Abstract
Introducció
Objectius
Metodologia:
         1.- Obtenció de la seqüència problema
         2.- Obtenció d’homologies:
              2.1.- Homologia a nivell de seqüència
              2.2.- Homòlegs estructurals
                   2.2.1.- Anàlisi de les proteïnes
                   2.2.2.- Superposició d’estructures
         3.- Obtenció del perfil i aliniament
         4.- Modelat de la proteïna
              4.1.- Prosa II
              4.2.- Procheck
         5.- Optimització del model
              5.1.- Modelatge dels loops
              5.2.- Minimització d’energies
         6.- Estudi de la Dinàmica Molecular
Resultats:
         1.- Obtenció de la seqüència problema
         2.- Obtenció d’homòlegs
            2.1.- Homologia a nivell de seqüència
            2.2.- Homòlegs estructurals
                 2.2.1.- Superposició d’estructures
         3.- Obtenció del perfil i aliniament amb el HMM
         4.- Modelat de la proteïna
         5.- Optimització del model
              5.1.- Modelatge dels loops
              5.2.- Minimització d’energies
         6.- Estudi de la Dinàmica Molecular
Discussió
Bibliografia

PROGRAMA DE RECONEIXEMENT DE MOTIUS D'UNIÓ A ATP
 
 

ABSTRACT

La relació entre els nucleòtids (codons) i els aminoàcids s’estableix mitjançant les reaccions que porten a terme les aminoacil-tRNA sintetases. Aquests enzims uneixen els seus substrats –ATP, aminoàcids i tRNA- i estabilitzen els estats de transició en la reacció d’aminoacilació.
En aquest treball s’ha modelat l’estructura tridimensional de la tirosil-tRNA sintetasa d’Aquifex aeolicus i s’han analitzat les seves característiques estructurals i funcionals.
El treball inclou el disseny d’un programa que permet la identificació de totes les molècules que continguin un motiu d’unió a ATP, entre les quals es troben les aminoacil-tRNA sintetases.
 

INTRODUCCIÓ

La reacció, anomenada d’aminoacilació o càrrega dels tRNAs, es porta a terme en dos passos. En primer lloc, l’aminoàcid és activat quan ataca una molècula d’ATP, donant lloc a un intermediari, l’aminoacil-adenilat, i a pirofosfat inorgànic. En segon lloc, l’aminoàcid és transferit a la ribosa terminal 3’del tRNA corresponent, donant lloc a l’aminoacil-tRNA i a AMP.
 

Classes i subgrups

La funció que realitzen les aminoacil-tRNA sintetases és comú per totes les proteïnes d’aquesta família, però són extremadament diverses pel que fa al seu tamany molecular, estructura quaternària i seqüència.  La comparació de les seves seqüències conjuntament amb el seu anàlisi tridimensional, va permetre descobrir algunes característiques comunes que divideixen la família en dues classes (5). L’aminoacil-tRNA sintetasa modelada en aquest treball és la tirosil-tRNA sintetasa d’Aquifex aeolicus i pertany a la classe I.

Les aminoacil-tRNA sintetases de classe I tenen els motius de seqüència conservats HIGH i KMSKS. El nucli catalític té una estructura similar al plegament de Rossmann d’unió a nucleòtids (1). Els dos motius conservats formen part del domini d’unió a ATP (fig.1).
 

Fig 1. Domini catalític de les aminoacil-tRNA sintetases de classe I.
En aquest cas es tracta de la GlnRS. L’ATP i el lloc acceptor del tRNA corresponent estan en vermell. La localització dels motius característics
està indicada de la manera següent: MSK (blau fort), i HIGH (vermell).

Les aminoacil-tRNA sintetases malgrat ser molt diverses en estructura quaternària, presenten alguns patrons. Les sintetases de classe I són principalment monomèriques, excepte la TyrRS i la TrpRS que són dímers obligats. Les sintetases de classe II tendeixen a ser dímers.
 
 

	Classe I	Classe II
Motius conservats	HIGH, KMSKS	Motiu 1, 2 i 3
Plegament del lloc actiu	Làmina beta paral·lela (plegament de Rossmann)	Làmina beta antiparal·lela
Lloc d’unió al tRNA	Solc menor	Solc major

Taula 1. Principals característiques diferencials de les dues classes d’aminoacil-tRNA sintetases.

També s’han trobat característiques comunes addicionals entre alguns membres de cada classe, i això ha permès la divisió de cada classe en subgrups. Els subgrups no només depenen de la presència de mòduls comuns, també estan relacionats amb el tipus d’aminoàcid que les sintetases transfereixen al tRNA. La tirosil-tRNA sintetasa conjuntament amb la triptofanil-tRNA sintetasa pertanyen al grup dels enzims que  carreguen aminoàcids aromàtics als tRNAs.

S’han identificat per homologies de seqüència proteïnes semblants a les sintetases. Aquestes proteïnes consisteixen principalment en un sol domini de les aminoacils, la qual cosa reforça la idea que les sintetases tenen un disseny modular. Per tant, les sintetases són el resultat de l’ensemblatge de vàries peces al llarg de l’evolució.
És lògic que per aquest motiu les empremtes d’aquests enzims apareguin en llocs insospitats. Un exemple d’aquestes homologies de seqüència l’il·lustra un tipus de citoquina que s’assembla molt al domini C-terminal de la tirosil-tRNA sintetasa de mamífers. S’assembla fins a tal punt que tallant aquest extrem de la TyrRS s’observa la mateixa activitat que la citoquina (3 i 4).
 

OBJECTIUS

Els objectius d’aquest treball es poden resumir en 2 punts molt concrets:

- Modelatge de la tirosil-tRNA sintetasa a partir de proteïnes homologues. D’aquesta manera es pretén determinar l’estructura tridimensional de la tirosil-tRNA sintetasa d’Aquifex aeolicus, identificar-ne llurs dominis estructurals i funcionals, analitzar-ne la relació estructura-funció, i estudiar les semblances i diferències amb d’altres tirosil-tRNA ja modelades.

- Disseny d’un programa que permeti identificar les característiques del domini d’unió a ATP. Això ens serà útil, ja que, com s’ha dit, la tirosil-tRNA sintetasa té un domini d’unió a ATP, el qual és imprescindible per dur a terme la seva funció.
 

METODOLOGIA

A continuació es detallen els passos i el procediment seguits en l’obtenció de l’estructura tridimensional de la tirosil-tRNA sintetasa d’Aquifex aeolicus, la qual s’anirà modelant per tal d’obtenir una estructura el més optimitzada possible.
 

1.- Obtenció de Seqüència

Per a l’obtenció de la seqüència en format FASTA de la tirosil-tRNA sintetasa d’Aquifex aeolicus (O67632) s’ha recorregut a la base de dades Swissprot.

2.- Obtenció d’homologies

2.1.- Homologia a nivell de seqüència

Blast al Swissprot per tal de trobar homologies de seqüència i alineament amb Clustalw.

2.2.- Homòlegs estructurals

Blast a la base de dades PDB, per tal d’obtenir homòlegs estructurals de la tirosil-tRNA sintetasa d’Aquifex aeolicus. S’escullen els que presenten E-values més petits i, per tant, més homologia estructural, juntament amb alguns altres que presentin valors més elevats per tal que, un cop es faci la superposició d’estructures, s’obtingui una superposició amb el mínim de regions que presentin “buits” o “gaps” estructurals.

2.2.1. - Anàlisi de les proteïnes

Es recorre a la base de dades SCOP per conèixer algunes característiques de les proteïnes homòlogues com la família a la qual pertanyen, etc. Això permetrà reduir l’aleatorietat a l’hora de triar els pdbs.

2.2.2.- Superposició d’estructures

Es sobreposen els 7 pdbs homòlegs mitjançant el Stamp per tal de determinar el grau de semblança estructural a través de la visualització de les estructures amb el Rasmol.

3.- Obtenció perfil i alineament

Es crea un perfil de HMM (Hidden Markov), per cadascun dels grups estructurals diferenciats que ha mostrat la superposició amb l’Stamp. Es determina l’Score de semblança entre el perfil i la seqüència problema, la qual cosa permet saber quin dels dos grups estructurals és més semblant a la proteïna problema. I s’alinea  la proteïna problema amb el perfil més semblant a la tirosil-tRNA sintetasa d’Aquifex aeolicus, és a dir, el perfil més apte per modelar la proteïna problema. De l’alineament resultant es talla l’extrem C-terminal, ja que no és informatiu.

4.- Modelat de la proteïna

S’obté una primera aproximació del model de la tirosil-tRNA sintetasa d’Aquifex aeolicus mitjançant el programa Modeller.
S’analitzen l’estabilitat de l’estructura en funció de:

4.1.- L’espectre d’energies mitjançant Prosa II. Aquest programa, basat en l’anàlisi de potencials estadístics, permet saber quin dels models obtinguts és millor quant a l’estabilitat energètica.

4.2.- Els angles, mitjançant Procheck. S’obté un mapa de Ramachandran (i una taula) on s’hi poden observar el % d’aminoàcids que, segons els angles phi i sigma, són correctes (“core”), permesos (“allow”), generosament permesos (“gener”) o dissolts (“disall” o no permesos). També informa sobre el nombre de “bad contacts” (o interaccions no permeses), entre d’altres.

5.- Optimització del model

5.1.- Modelatge dels loops

Un cop obtingut un primer model es determina l’existència de loops i es modelen utilitzant la base de dades http://ibb.uab.es/loops

5.2.- Minimització d'energies

La minimització d’energies es fa mitjançant Grumos. Se superposa mitjançant el Xam el primer i l’últim model per tal d’obtenir un format que el Prosa II i el Procheck puguin reconèixer posteriorment. S’analitza l’estabilitat estructural, a partir de l’espectre energètic i els angles, dels models optimitzats amb el Grumos.

6.- Estudi de la Dinàmica Molecular

A partir del model optimitzat amb el Grumos es fa un estudi de la Dinàmica Molecular amb l’opció Dynamic del Grumos. Aquest estudi permet analitzar la flexibilitat de la proteïna, a base d’explorar tot l’espai conformacional possible.
 

RESULTATS

1.- Obtenció de la seqüència problema

La seqüència de la tirosil-tRNA sintetasa d’Aquifex aeolicus, en format FASTA és la següent:

>sp|O67632|SYY_AQUAE Tyrosyl-tRNA synthetase (EC 6.1.1.1) (Tyrosine--tRNA ligase) (TyrRS) - Aquifex aeolicus.
MTPEEQLRIIKEGTVEIIEEEELLKKLKEGRPLRVKAGFDPTAPDLHLGHVVLLQKLRQFQQLGHEVFFIIGDFTAMIGDPTGRSQTRPPLSREQVLENAKTYEHQVFKVLIPEKTTVVFNSTWLEELGTKGLIELCAKYTVARMLEREDFSKRFKEGIPIYIHEFIYPLLQAYDSVAIKADVEIGGTDQKFNLLIGRDIQREYGQEPQVCITLPLLVGTDGVRKMSKSYGNYVGITEDPKTMFAKIMSIPDEIMWDWFLLLTDYNKEEIEKMRREMHPMEAKKLLAFTIVKRFHSEEEARKAKEWWEKTFSQREFPEDAPLVKLNEKKLRAVDFLVKIGAVKSKNEARRVIQGGGLKINGEKVTDPNTEIEINGELKVKVGKKKFYRVVSG

2.- Obtenció d’homòlegs

2.1.- Homologia a nivell de seqüència

S’ha realitzat un anàlisi d’homologies de seqüència de la tirosil-tRNA sintetasa d’Aquifex aeolicus a nivell de seqüència mitjançant un Blast a la base de dades Swissprot. Un cop analitzats els resultats obtinguts tenint en compte els E-values, les seqüències a partir de les quals es realitza, mitjançant el Clustalw, un alineament de seqüència són:

 O67632 Aquifex aeolicus
 P43836 Haemophilus influenzae
 P56417 Helicobater pylori
 P41256 Thiobacillus ferrooxidans
 P75122 Mycoplasma pneumoniae
 P22326 Bacillus subtilis
 O83806 Treponema pallidum
 O29482 Archaeoglobus fulgidus
 P54577 Homo sapiens
 P36421 Saccharomyces cerevisiae
 O67115 Aquifex aeolicus
 P00952 Bacillus stearothermophilus
 Q99TD5 Staphilococcus aureus
 

Dels resultats obtinguts no s’observa cap “gap” o buit en cap regió present a totes les seqüències. No obstant, i tot i que els resultats obtinguts no són dolents, s’ha decidit abandonar aquest camí, ja que, la informació obtinguda mitjançant anàlisis estructurals serà més rellevant en el treball que ens ocupa. Decidits a abandonar, doncs, aquesta línia, tot el que segueixi a continuació farà referència a l’anàlisi estructural de la proteïna, a partir de les homologies estructurals trobades al PDB.

1.2.- Homòlegs estructurals

Els homòlegs estructurals s’han obtingut mitjançant un Blast a PDB a partir de la seqüència O67632 en format FASTA de la tirosil-tRNA sintetasa d’Aquifex aeolicus. Els homòlegs estructurals que s’ha escollit per modelar la proteïna són els que es mostren a continuació:
 
 

Quadre 1. Homòlegs estructurals, en format pdb, de la proteïna problema.

1.2.1- Superposició d’estructures

S’ha realitzat una superposició de les estructures homòlogues per tal de determinar visualment les semblances i diferències de les proteïnes homòlogues escollides. El resultat d’aquesta superposició amb l’Stamp l’hem visualitzat amb el Rasmol, i evidencia l’existència de dos grups estructuralment diferents. Un és format pels pdbs 1D2R i 1I6M corresponents a la tirosil-tRNA sintetasa de Bacillus stearothermophilus, i l’altre grup és format d’una banda pels pdbs 1JIL, 1JIK, 1JII, 1JIJ, corresponents a Staphilococcus aureus, i d’altra banda pels pdbs 1TYA, 1TYB i 1TYD, corresponents a Bacillus stearothermophilus.
 
 

Fig 2. Superposició dels pdbs homòlegs a la proteïna problema. Es diferencien dos grups clarament diferenciats que corresponen a:
I: 1D2R i 1I6M
II: 1JIL, 1JIK, 1JII, 1JIJ,1TYA, 1TYB i 1TYD.

3.- Obtenció del perfil i alineament amb HMM

S’ha realitzat un perfil HMM amb cadascun dels dos grups d’homòlegs estructurals per tal d’esbrinar quin grup és més semblant a la tirosil-tRNA sintetasa d’Aquifex aeolicus i per tant més apte per modelar la proteïna problema. Els resultats de l’hmmsearch, evidencien una major semblança entre la proteïna problema i els homòlegs estructurals del grup II, amb un score de 1.9e-20.

Donat que la tirosil-tRNA sintetasa d’Aquifex aeolicus presenta un grau de semblança molt més elevat amb els homòlegs estructurals del grup II, es modelarà la proteïna utilitzant aquest grup de templates, a partir de l’alineament de la nostra proteïna problema amb el perfil de templates creats mitjançant l’hmmalign. A  aquest alineament se li retalla la cua C-terminal ja que no queda alineada i no aporta informació.

4.- Modelat de la proteïna amb Modeller

Mitjançant el programa Modeller s’obté una primera aproximació a l’estructura tridimensional de la tirosil-tRNA sintetasa d’Aquifex aeolicus. Aquest model s’analitza mitjançant el Prosa II i el Procheck, i són els que es mostren a continuació:
 
 

Fig.  3.: A: Resultat del primer modelatge. B:Espectre d’energies del
Prosa II del model obtingut amb el Modeller per a la tirosil-tRNA sintetasa d’Aquifex aeolicus.

Fig.  4: Resultats del Procheck A: Resum.    B: Mapa de Ramachandran

5- Optimització del model

5.1.- Modelatge dels loops

Observant l’alineament obtingut a partir del perfil de HMM, s’aprecia un gap de 2 aminoàcids (IP) que no presenta homologia amb cap de la resta de proteïnes, i que es correspont a un loop estructural situat entre dues hèlix alfa. És en aquesta petita regió on s’ha centrat l’atenció per millorar el model mitjançant la cerca d’un loop conegut que pugui omplir aquest petit buit. S’han trobat resultats per cobrir aquest petit gap, malgrat tot, els resultat obtinguts no han estat prou bons com per incorporar-los al model, ja que el valor d’score no ha estat suficientment bo.

Els resultats no són gaire bons, ja que el valor dels scores és de –2 (aprox.) per als dos models obtinguts (per ser bons hauria de ser < -50). Per tant, doncs, no ens serveix per optimitzar el model. Abandonem aquesta via i es procedeix a la realització de la Dinàmica Molecular.
 

5.2.- Minimització d’energies amb Grumos

S’ha realitzat una minimització d’energies mitjançant Grumos i s’han obtingut 10 models. El perfil energètic ha anat millorant durant l’optimització, tal com es mostra en la figura 5B.

Fig. 5:  A: Visualització del model optimitzat mitjançant el Rasmol.B: Comparació entre el primer i el darrer pas d’optimització, obtinguda mitjançant el Prosa II.  C: Resum del Procheck pel  model optimitzat; D: Mapa de Ramachandran.

Tal com es pot observar en la figura 4, l’optimització mitjançant el Grumos ha permès millorar el model. En primer lloc s’ha disminuït els nivells energètics, en segon lloc s’ha  reduït el nombre de contactes desfavorables de 16 a 1, i el nombre de residus localitzats a la zona no permesa del mapa de Ramachandran ha disminuït força. Malgrat tot, es veuen una sèrie de punts, tot i que no són gaire, que estan a la zona dels “no permesos”. L’anàlisi d’aquests residus revela la no rellevància funcional, tot i que formen part de loops i no n’hi ha cap que estigui formant part d’una hèlix alfa o làmina beta.
 

6.- Estudi de la Dinàmica Molecular

Després de minimitzar les energies mitjançant dinàmica molecular, no hi ha hagut variació significativa d'energies, tal com s'observa a la figura 6A i, comparant la figura 6B amb el sumari del Procheck obtingut en el la minimització d'energies amb el Grumos (figura 5C), no s'aprecien diferències significatives en els resultats. Això fa pensar que la minimització d'energies amb el Grumos ha sigut molt satisfactòria.

Fig. 6.: A: Comparació entre el model sense optimitzar (vermell), primer (blau fosc) i  darrer pas d’optimització (blau clar) i model optimització per dinàmica (groc), obtinguts mitjançant el Prosa II.  B: Resum del Procheck pel  model optimitzat per dinàmica molecular ; C: Mapa de Ramachandran.

L’estudi de dinàmica de la proteïna permet analitzar la flexibilitat de la proteïna. Una primera aproximació visual del dinamisme de la proteïna es pot veure a continuació:
 

Fig. 7.: Diferents visions de la dinàmica molecular de la proteïna: cadena, estructura i ribbons, respectivament.

S'ha analitzat el dinamisme de la proteïna mitjançant el B-factor. Aquí es mostren els resultats obtinguts:
 

Fig. 8.: Representació de les fluctuacions per a cada residu aminoacídic.

CONCLUSIONS

A partir de la seqüència en format FASTA de la tirosil-tRNA sintetasa d’Aquifex aeolicus O67632 s’ha aconseguit modelar la proteïna utilitzant 7 templates. Analitzant els resultats obtinguts se’n pot definir la seva estructura tridimensional.

La tirosil-tRNA sintetasa d'Aquifex aeolicus és un enzim dimèric. Cada subunitat consta de dos dominis: un domini catalític (color turquesa i rosat a la figura 9), la funció del qual és unir ATP i tirosina, i un domini format per alfa-hèlixs, de funció desconeguda.
 

Fig 9. Dominis de la tirosil-tRNA sintetasa d'Aquifex aeolicus. La part inferior (blau turquesa) correspon a un domini catalític amb plegament de Rossman. La part superior (lila) correspon a un segon domini format per hèlix alfa, amb funció desconeguda.

Fig. 10.: Domini catalític amb 6 làmines beta (marcades amb blau turquesa a la figura).

Les hèlixs alfa que connecten les cadenes beta 2 i 3, i les cadenes beta 3 i 4, es troben situades a una banda de la làmina beta, mentre que les hèlixs alfa que connecten les cadenes beta 4 i 5 i les cadenes beta 5 i 6 es troben situades a l'altra banda de la làmina, tal com s'observa a la figura 11.

El centre actiu (groc a la figura 12) es localitza als extrems C-terminals de les cadenes beta 2 i 5. El loop entre aquestes cadenes beta i els seus alfa-hèlixs és el lloc d'unió al substrat, el qual, concretament s'uneix a través dels residus 38-47 (loop 2) i 190-193 (loop 5). Al centre actiu s'hi uneix la tirosil-adenilat mitjançant ponts d'hidrogen. Aquest substrat també s'uneix als residus 173 i 177 de l'alfa hèlix que connecta les cadenes beta 4 i 5, i amb alguns residus de la cadena beta 2.
 

Fig. 12.: Centre actiu de la tirosil-tRNA sintetasa d'Aquifex aeolicus (en groc a la figura).

El coneixement de l'estructura i la funció de la tirosil-tRNA sintetasa suposa un pas endavant en l'apassionant món d'aquesta família de proteïnes, que van aparèixer en les primeres etapes de l'origen de la vida. L'estudi de la seva estructura tridimensional ens fa adonar de la importància que tenen en el manteniment de la vida, ja que la seva "petjada" es troba en moltes altres proteïnes, la qual cosa confirma el seu origen llunyà i ens aporta una peça més en l'estudi del misteri de la vida.

BIBLIOGRAFIA

I si voleu saber més sobre les aminoacils... visiteu:

Bacardit M., Coll M., Gabernet N. Hostes vingueren i a sorgir ens empenyeren! Origen endosimbiòtic dels
mitocondris i arbre sense arrel de tots els organismes vius, a partir de les aminoacil t-RNA sintetases.
Pràctiques d’evolució, 2001.

Bacardit M., Coll M., Gabernet N. Aminoacil-tRNA sintetases. http://www1.imim.es/courses/BioinformaticaUPF/projectes/1.6

            M.Mercè Bacardit i Reguant, Montse Coll i Lladó, Núria Gabernet i Díaz i Jon Portuondo i Murguiondo

                                                                © Biologia Estructural-2002

      Per qualsevol dubte o aclariment no ho dubtis i escriu-nos un e-mail:     merce.bacardit01@campus.upf.es
                                                                                                                  montserrat.coll02@campus.upf.es
                                                                                                                  nuria.gabernet01@campus.upf.es
                                                                                                                  jon.portuondo01@campus.upf.es