ANÀLISI DE L’ALCEU AMB COFACTORS

 

 

PLEGAMENT DE L’ALCEU

 

 

En la base de dades SCOP es va trobar que la família de les ADH tenien un Rossmann fold (beta-alpha-beta motif for binding NAD) en el domini d’unió al cofactor.

 

Això es va comprovar en el monòmer de l’alceu, on s’observà una làmina beta rodejada d’hèlixs alfa en la zona d’unió al cofactor.

 

A més, es mirà les estructures secundàries presents en el model d’alceu optimitzat i es trobaren 8 hèlixs alfa i 19 cadenes beta. I a la regió del loop conflictiu, residus 90-130, finalment apareixien les següents estructures secundàries: 1 tros d’hèlix alfa, 7 cadenes beta (4 són d’un residu) i la resta era loop o indeterminat. (loop)

 

 

 

DOMINIS I INTERACCIONS DE L’ALCEU

 

 

La família de les ADH és una família proteica molt conservada durant l’evolució i amb una funció universal. La seva estructura té un domini de dimerització, un domini de zinc, un per unir el coenzim i un per unir el substrat, per cada monòmer.

 

Dominis d’unió a zinc i al coenzim: (domznnad)

 

-          amb la base de dades SCOP es trobà que totes les ADH tenien un domini d’unió a ZN

-          es va consultar un estudi previ realitzat sobre les ADH humanes (http://www1.imim.es/courses/BioinformaticaUPF/projects/1.9/matriu.htm) en el que es consultaren les bases de dades Prosite, Interpro, Reverse Position specific Blast i PfamProsite, Interpro, Reverse Position specific Blast i Pfam. Els resultats obtinguts foren que el domini de zinc era el més conservat en les ADH. L’estudi es va basar en la seqüència consens d’aquest domini trobada en Pfam.  Es va veure que el domini de zinc de Pfam era gairebé de la mateixa longitud que la seqüència del mRNA, de manera que no es veia una correlació seqüència-funció específica per a cada ADH. Les conclusions de l’estudi foren que potser aminoàcids puntuals de l’estructura tridimensional de la proteïna tenien un paper essencial en la funció.

 

      Seqüència consens del Pfam:

 

               AVGGGPKVLEVEEVPVPPPGPGEVLVKVLAAGICHSDLHLYKGGYPLPPVKPLVLGHEGA
               GVVVEVGSGVTGFKVGDRVVVLPLVGCCGCEYCKSGRENLCPKDGFGGFTGDGGFAEYVV
               VPAAFLVKIPDGLPLEEAAALGCAGLTAYGALVRAAKVLPGDTVLVHGAGGVGLAAIQLA
               KAAGAARVIAVDSSEKKLELAKELGAADFVNNSRKEDFVEAIKELTGGGVDVVLDCGGGA
               TLDAALALLKPGGRLVVVGVPGGGVPIPLPFDLLLKERSIKGSFLGGRKPDELREALDLL
               ASGIGVLKPLITHTLPPLDEAPEAFELMESGKHTGKVVVIP

 

 

 

 

 

 

Per cada monòmer el subdomini d’unió al zinc s’indica en verd i el d’unió al coenzim (NAD o NADP) s’indica en lila.

 

En humans, el domini d’unió a zinc és essencial per aquesta família de proteïnes ja que un dels àtoms de zinc és necessari per l’activitat catalítica mentre l’altre no ho és.

 

Segons Zhong-Ning Yang et al. (1999) existeixen uns residus crítics a nivell estructural i funcional (His47 i el Glu68). La Histidina és un residu involucrat en la transferència del H+, alliberat després de la reacció d’oxidació, i també té un paper important en la unió del cofactor NAD. El Glutàmic és el residu responsable per la coordinació directa de l’àtom de Zn catalític, coordinació que és important alhora de disminuir el pka dels alcohols per dur a terme la reacció d’oxidació.

En canvi, en l’estudi de les ADH humanes es trobà la His47 només en algunes ADH ja que en les altres es trobà que aquesta estava en posició 51, i en comptes de trobar el Glu68 es trobà una Isoleucina en aquesta posició.

 

-          El residu Cys37, His59 i Asp150 es trobaren a la bactèria T.brochii interaccionant amb l’àtom de  zinc. (http://www.weizmann.ac.il/Organic_Chemistry/burstein.shtml)

 

-          A partir d’aquí es buscaren aquests dos subdominis en la proteïna bacteriana ALCEU. (domznnad).

 

Es van mirar les interaccions del zinc amb les cadenes laterals dels amimoàcids més propers de l’alceu i es va veure que no interaccionaven, ja que estaven a una distància superior a 2.8 Å. Es suposà que això era degut a que no estiguessin ben modelades les cadenes laterals en el model generat.

 

El Glu68 o Ile68 (humans) coincideix amb la Ile68 en la proteïna alceu, però la distància entre el zinc i el residu és molt superior a 2.8 Å.

 

Segons una web els residus trobats a T.brochii es buscaren a l’alceu. La Cys37 corresponia a una Thr (tots dos polars), la His59 era una Thr (tots dos polars), el Glu60 era una Val (el primer polar i el segon hidrofòbic) i la Asp150 era una Leu (sent el primer polar i el segon hidrofòbic).  Quan s’observaren la localització d’aquests residus al model es va veure que estaven massa distants del zinc.

També es van analitzar les interaccions amb el cofactor NADP del model, que, recordem, hauria de ser NAD en el cas de l’alceu.

 

RESIDU

PROTEÏNA

RESIDU

CADENA LATERAL

RESIDU NAD

DISTÀNCIA

(Å)

ASP (167)

OD2

C4

2,487

OD1

C4

2,534

OD2

C5

2,699

OD1

O7

2,855

ALA (191)

CB

O4

1,918

ILE (195)

CG2

O2

2,310

HN

O2

2,551

ASP (215)

OD1

O2

2,283

CG

O2

2,868

O

C5

2,661

CD2

O4

2,654

ASN (217)

1H

O2

1,446

LEU (260)

CZ

O1

1,323

 

 

 

La His47 comentada en l’apartat anterior correspon en l’alceu amb el residu Ile47, i la His més propera és la 46. Podria ser que aquestes dos histidines fessin la mateixa funció.

 

Segons l’article “The catalytic reaction and inhibition mechanism of Drosophila alcohol dehydrogenase” la presència de la càrrega positiva de l’anell del coenzim NAD+ i la del residu Lys155, desprotona a l’aminoàcid Tyr151 a pH fisiòlogic. Tyr151 pot substreure el protó de la forma enòlica de la cetona i catalitzar un atac nucleofílic al carboni4 del coenzim creant un aducte NAD-cetona. En el model de la proteïna bacterina alceu, el residu 155 és una Arg i el residu 151 és una Thr. Encara que han canviat els aminoàcids, les característiques d’aquest són les mateixes; els residus 155 (Lys i Arg) tenen càrrega positiva i els residus 151 (Tyr i Thr) són polars.

La funció dels residus en aquestes posicions es pot haver mantingut al llarg de l’evolució per canvis conservatius, encara que s’ha observat que les distàncies entre els àtoms implicats són molt superiors a 2.8 Å.

 

En la pàgina web (http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/pdbsum/1kev/main.html) es veien els residus de la proteïna kev que interaccionaven amb el NADP i el Zn. A l’analitzar els mateixos residus en el model de la proteïna alceu, no es va trobar que cap estigués a una distància menor a 2.8 Å, ni tan sols aquells que eren el mateix aminoàcid. També s’analitzaren els residus que formaven part del centre actiu del kev i cap d’ells coincidia.

Una perspectiva de futur podria ser fer un stamp del kev amb el model i veure quins residus són els que corresponen a l’alceu i analitzar si aquests fan el mateix tipus d’interaccions i, per tant, si se’n conserva la funció.

 

Leu260 es troba en un loop entre dos cadenes beta que formen part del plegament Rossman. Podria ser que formés part del topological switch point. Això requeriria fer un diagrama topològic d’aquest plegament, per tal de verificar aquesta hipòtesi.

 

Domini d’unió al substrat:

 

-          En l’estudi fet amb ADH humanes es trobà que les dues subunitats del dímer s’encaraven pel subdomni d’unió al coenzim, deixant els subdominis catalítics als extrems. La proteïna passa per diferents estats conformacionals al llarg de tot el procés de detoxificació d’alcohol; així, en un principi la molècula es troba en la seva conformació totalment oberta que permet la unió del Coenzim i el solvent; a continuació els subdominis catalítics es tanquen parcialment sobre els subdominis centrals deixant una escletxa, la obertura de la qual determina o afavoreix la unió de determinats substrats. Tot i que el plegament de les proteïnes és molt similar l’escletxa deixada pels subdomini catalític és de diferent amplada en funció dels residus veïns. És per aquest motiu que tot i l’extremada semblança entre les diferents seqüències, els isoenzims presenten diferent especificitat de substrat.

 

-          En els humans el domini d’unió al substrat està disposat estructuralment en dos segments no continus, rodejant el domini d’unió a NAD de manera que quan es plega els dos segments s’encaren per formar un únic domini d’unió a substrat   (http://www.molevol.org/camel/publications/sszld94/SSZLD.fig1.html).

 

-          L’estructura observada en el monòmer de l’alceu segueix una disposició semblant degut a la alta conservació estructural d’aquesta família de proteïnes. En el tetràmer es veu un buit en el centre rodejat pels quatre monòmers, aquesta cavitat té una superfície de potencial positiu. Aquí s’uneix el substrat. (domdimsubs)

 

Domini de dimerització:

 

-          En l’estructura del dímer de l’alceu es pot veure clarament la zona d’unió dels dos monòmers. En cada monòmer, aquesta zona està formada per un conjunt d’estructures secundàries (una alfa i vàries betes) que formen una pinça per unir-se al domini de l’altre monòmer (pinces). Aquest domini es troba conservat en tots els templates utilitzats i comprèn els residus 262-305 en l’alceu. A més, en aquest domini trobem la part C-terminal del plegament Rossman (una alfa i una beta) implicada en el domini de dimerització.

 

-          El tetràmer està format per dos dímers i cada dímer és homòleg estructuralment als dímers de les ADH dels vertebrats. Els dímers formen el tetràmer oposant l’escletxa formada per un dels dímers a l’altra escletxa deixant aquestes escletxes accessibles al substrat en el centre. (domdimsubs)