RESULTATS I DISCUSSIÓ

La proteïna alceu pertany a la família de les alcohol deshidrogenases, un conjunt molt homogeni i conservat de metalo-enzims que formen dímers o tetràmers. L’alceu pertany a la bactèria Alcaligenes Eutrophus i per poder desenvolupar la seva activitat catalítica (oxidació reversible d’alcohols a aldehids o cetones) forma un homotetràmer i utilitza com a cofactors NAD+ i Zn. Cada monòmer té 366 aminoàcids on trobem quatre dominis: domini de dimerització, de zinc, d’unió al NAD⁺ i d’unió al substrat (alcohol).

Per tal d’aconseguir l’objectiu de fer un model tridimensional de l’alceu, es van realitzar uns models previs:

- Els models inicials (seqüencial i estructural) contenien 7 templates, dels quals dos es van haver d’eliminar perquè empitjoraven l’energia del modelatge.

- Els següents models, realitzats amb 5 templates, van servir per escollir els models estructurals en comptes dels seqüencials. Tot i així, els models estructurals presentaven una regió amb energia positiva que corresponia a un loop.

- En el següent pas es van seguir una sèrie d’estratègies per tal de millorar el modelatge d’aquesta regió i, per tant, disminuir-ne l’energia. Malgrat tot, no es va aconseguir aquest objectiu.

- Es van fer els models estructurals definitius de la proteïna a partir de 4 templates. Els dos millors models, escollits per la baixa energia, es van optimitzar i finalment, la seva energia era inferior a cero i no hi havia bad contacts en els residus modelats. El millor model s’analitzà amb dinàmica molecular i s’observà que la regió del loop, que s’havia intentat modelar sense èxit, era una zona molt fluctuant que apareixia amb energia positiva majoritàriament. Amb el B-factor es descobriren altres zones amb fluctuacions que no corresponien a loops i on, segurament, la fluctuació era deguda a un mal modelatge d’aquestes zones.

Un cop aconseguit el model definitiu de l’alceu es va construir el model amb els seus cofactors (NAD i Zn). S’utilitzaren dos templates, l’humà i la bactèria Kev, però finalment s’escollí la bactèria (malgrat que té NADP) perquè permetria fer un tetràmer i per similaritat.

En l’anàlisi d’aquest model es comprovà que aquesta proteïna té un Rossman fold (característic de les ADH) en el domini d’unió al cofactor que forma part del domini de dimerització. En el domini d’unió a cofactor i en el d’unió a zinc, es trobaren certs residus d’alceu, coincidents o amb canvis conservatius, en les ADH d’altres organismes. A més, el domini d’unió a substrat i el de dimerització també es troben conservats en tots els templates. Tots els resultats de l’anàlisi del model alceu donen suport a que hi ha una gran conservació de la seqüència i l’estructura en la famíla de les ADH al llarg de l’evolució.

El model resultant no està ben modelat en zones concretes, com per exemple en el loop 90-130, ja que, encara que el model optimitzat tenia energia negativa, amb la dinàmica es veu una gran fluctuació i energia positiva en aquesta zona.

Una altra zona que es creu que està mal modelada és aquella que interacciona amb els cofactors. Poden haver-hi diverses explicacions possibles per aquest fet. La primera és que el modelatge no hagi estat del tot correcte perquè el programa MODELLER ha intentat forçar les zones d’interacció amb els cofactors perquè adoptin una conformació que aforeixi l’estabilitat global de la proteïna. La segona és que el NAD pugui adoptar diferents conformacions dins la cavitat del domini d’unió a NAD, de manera que la conformació que hi ha al nostre model no correspon a la que hi ha en realitat. A més, s’ha de tenir en compte que el model té NADP en comptes de NAD i això haurà influenciat la posició i interaccions del grup NAD. Respecte al zinc, la conclusió és que deu estar mal modelat perquè les distàncies als residus que l’estabilitzen són massa grans, o que el NADP el fa estar en una posició diferent a la que estaria si el model tingués NAD. Encara que el fet de que hi hagi NAD o NADP no influencia la conformació de la proteïna, pot ser que influenciï la posició del zinc.

PERSPECTIVES DE FUTUR

· El model alceu obtingut no presenta unes distàncies adecuades per interaccionar amb els seus cofactors segons els papers de referència. Una proposta de millora seria fer un model estructural només de la zona del centre actiu per veure si milloren les interaccions.

· Una altra proposta de millora podria ser fer un stamp del kev amb el model i veure quins residus del kev que interaccionen amb els cofactors corresponen a l’alceu i analitzar si aquests, fan el mateix tipus d’interaccions i, per tant, que se’n conserva la funció.

· Es podria fer un diagrama topològic del plegament Rossman per comprovar si el topological switch point contè la leucina 260 i, per tant, està conservada en les ADHs.

· Fer estudis comparatius d’una adh homotetramèrica bacteriana amb NAD i l’alceu per veure si canvia la conformació dels cofactors dins la cavitat del domini d’interacció. Si no es trobès cap adh bacteriana amb les característiques necessàries, es podrien fer estudis comparatius amb un template homòleg que tingui NAD, per exemple, l’humà.

· Les bactèries usades com a templates (C.beijerinckii i T.brockii) tenen alcohol deshidrogenases termoestables degut a la seva estructura quaternària en forma de tetràmer. Seria interessant fer estudis de termoestabilitat en l’alceu per saber si presenta aquestes caraterístiques.

· Síntesi de compostos quirals amb ADH. La síntesi d’alcohols quirals mitjançant ADH només s’ha aconseguit a escala de laboratori, ja que aquests enzims tenen limitacions tècniques: falta d’especificitat de substrat, estabilitat i enantioselectivitat. Una proposta seria fer mutagènesi dirigida per aconseguir ADHs millorades i comprovar, amb programes informàtics, que siguin estables i que es puguin usar a nivell industrial per sintetitzar alcohols quirals.