MODELS INICIALS

MODEL SEQÜENCIAL

Les seqüències FASTA de les proteïnes template es van alinear amb CLUSTALW (ADHseq.aln).

L’alineament obtingut s’utilitzà per fer una matriu HMMER (build, calibrate i align) per tal de trobar un perfil seqüencial de les ADH a partir de les homòlogues escollides (adh.hmm) que es llençà contra la seqüència ALCEU per tal de rastrejar aquesta seqüència amb el perfil dels templates. Aquest fitxer es va haver de transformar a format clustalw (totesseq.aln) i després a format pir per poder-lo introduir en el programa MODELLER.

El programa MODELLER llegeix un arxiu (adhseq.top) on s’especifica la seqüència problema, els templates en format pdb i l’arxiu en format pir creat en el pas anterior per tal d’obtenir el model seqüencial de la proteïna ALCEU.

El model va ser visualitzat amb RASMOL (adhseq1.jpg)

MODEL ESTRUCTURAL

Els pdbs de les proteïnes template es van alinear estructuralment amb STAMP (adh6sp), l’arxiu obtingut es transformà a format clustalw (adhestr.aln) i després a format sp per visualitzar-lo al RASMOL. La superposició obtinguda era òptima per continuar endavant el modelatge perquè els templates eren molt semblants estructuralment.

A partir del fitxer obtingut amb el Stamp modificat s’utilitzà per fer una matriu HMMER (build, calibrate i align) per trobar un perfil estructural de les ADH, a partir de les homòlogues escollides, que llençàrem contra la seqüència ALCEU. Aquest fitxer es transformà a format clustalw (totesestr.aln) i després a format pir per poder-lo introduir en el programa Modeller .

El programa MODELLER llegeix un arxiu top on s’especifica la seqüència problema, els templates en format pdb i l’arxiu en format pir per tal d’obtenir el model estructural de la proteïna alceu.

El model va ser visualitzat amb RASMOL (adhestr1.jpg)

ANÀLISI DELS MODELS OBTINGUTS

Es van analitzar els models obtinguts amb el programa PROSA per tal de saber si el plegament dels models era favorable energèticament.

Els models seqüencials presentaven energia negativa al llarg de tota l’estructura excepte en la zona dels residus 20 al 30 on l’energia era de 0.4 i als residus 90 a 130 on tenia un valor de 0.2 (sessionalseq.cmd).

Els models estructurals també presentaren un pic d’energia positiva a les mateixes zones amb un valor de 0.1 entre els residus 20 i 30, i un valor de 0.5 entre els residus 90 i 130 (sessionalestr.cmd).

El primer pic d’energia positiva corresponia als primers residus i es podria evitar treient-los de l’alineament. El segon pic corresponia a un loop d’uns 40 residus i per millorar-lo s’haurien d’utilitzar altres estratègies.

El resultat esperat era un model estructural amb energia més favorable que el realitzat a partir de seqüència, ja que aquest no té en compte l’estructura al fer el model. Però el resultat va ser el contrari; el model seqüencial tenia energia més favorable que l’estructural. Per saber d’on provenia el pic d’energia positiva entre els residus 90 i 130 es van comprovar dos aspectes dels models:

Amb el programa RASMOL s’analitzà l’estructura del model compresa entre els residus 90 i 130.

Els models seqüencials tenien un loop (adhseq1.jpg)

Els models estructurals presentaven diferents estructures secundàries (alfes i betes) (adhestr1.jpg)

Es va mirar el perfil d’energia dels fitxers pdb dels templates amb PROSA (sessionh.cmd), ja que es sospitava que algun d’ells podia tenir energia positiva i això podria influenciar el model estructural.

S’observà que el pdb de ratolí (e3i) presentava el major pic d’energia en la regió conflictiva de 90 a 130, encara que tenia valors negatius, i també tenia un pic d’energia positiva en la regió del residu 300, que també era present en el pdb de bacallà. Per tant, es va decidir eliminar aquest template per tornar a fer un model on millorés l’energia. Al tornar a fer el modelatge, per problemes tècnics del programa MODELLER es va haver de treure el template de bacallà (cdo). El fet de treure aquests templates no afectaria negativament al modelatge, ja que eren els que tenien ressolució, e-value i score més baix.