Pràctica 6.2- Comparació de models

Pràctica 6.2- Comparació de models
Pràctiques de Biologia Estructural- Carlos Masdeu Ávila- Nia=16965
<< >>

1-Comparació d'estructures secundàries

Ara ens fixarem en com són les estructures secundàries dels nostres models i els evaluarem en funció d'aquestes. Utilitzarem dos programes:

Dssp,que fa un càlcul (a partir de l'estructura) per trobar l'estructura secundària de la proteína, i Psi-pred, que utilitza una base de dades per avaluar la seqüència i oferir-nos així un percentatge de probabilitat.

1.1-Psi-pred
Donem la comanda psipred clustal1.fa. Ell realitza un psiblast, i en funció dels resultats, ens oferirà un mapa d'estructura secundària o un altre.

Ens genera dos outputs, on s'ens indica el tipus d'estructura secundària que ell preveu a cada residu, així com la probabilitat associada.

clustal1.ss2 clustal1.horiz
(H vol dir helix, C vol dir unió, E vol dir làmina. Els nombres corresponen a probabilitats. Hi ha un script anomenat psipred.pl que converteix aquests aliniaments a format clustal, més entenedor: psipredpl.out)

1.2-DSSP
Dssp es crida de la següent manera: dssp <input> <output>
p.ex:

dssp clustal1.pdb clustal1.dssp

L'output de dssp, al provenir d'un input molt més complexe (pdb vs sequencia FASTA), és també molt més complet i complexe. D'una manera simil·lar a com ho feia psipred.pl, aliss es un script que, donant-li un ..dssp, ens dòna la estructura secundària en format FASTA.

aliss.pl clustal1.dssp > clustal1.2d

1.3-Comparant estructures secundàries
A fi de comparar els outputs emesos per tots dos programes, crearem un fitxer que contingui:
-la seqüència en fasta
-el output de dssp en fasta
-el output de psipred en fasta

Per fer-ho,

cat clustal1.2d psipredpl.out > clustal1.2nd
(Concatenem tots dos outputs en un sol fitxer)
(accesòriament podem retallar la seqüència amb un editor gràfic, ja que es trobarà repetida)
aconvertMod2.pl -in p -out c < clustal1.2nd > clustal1.2ncomp
(I ho convertim a format clustal)

Així, tenim a clustal1.2ncomp els alineaments de secuència i estructura secundària del model clustal1.

2-COMPARACIÓ DE MODELS I SELECCIÓ DEL MILLOR MODEL

Ara que ja tenim els models i coneixem les eines per comparar-los, passarem a comparar els diferents models mitjançant cadascun dels programes que hem anat veient:
2.1-Procheck
2.2-Prosa
2.2b-Análisi amb procheck II
2.3-Superposició d'estructures
2.4-Psipred/dssp

2.1-Análisis per procheck

2.1.1-RAMACHANDRAN PLOTS

	Al model clustal1 trobem que hi ha 3 residus (lys 61,asp73,ser266) que estàn en posicions "disallowed" (no permeses) mentre n'hi ha 3 que estan en regions rarament permeses.
	Aquest model (segon model generat amb l'alineament de seqüències) té molt més bona pinta que l'anterior. Trobem que el nombre de residus 'generosament' permesos és molt menor (només apareixen 2 al plot), i tenim tres residus que estan en posicions desfavorables (gln63,ser266,phe267)
	Tal com es veu el plot, hi ha molts residus que estàn a una zona desfavorable de la meitat dreta, tant al quadrant superior com inferior. Pel que fa als àtoms "generosament", en trobem bastants repartits pel plot.
hmm2	Aquest model està millorat respecte a l'altre realitzat amb l'alineament de hmm. Tal com es veu al plot, les úniques posicions que ens criden l'atenció són àtoms que estàn en posicions permeses "generosament",tret de la lys 61 que, tal com passava a l'altre model, queda en la zona "disallowed".

2.1.2-Summaries

Model	core	allow	gener	disall	Bad contacts
clustal1.sum	86.7%	11.1%	1.1%	1.1%	8
clustal2.sum	88.2%	10.0%	0.7%	1.1%	9
hmm1.sum	87.1%	10.0%	1.5%	1.5%	7
hmm2.sum	87.5%	10.0%	2.2%	0.4%	9

Tal com podem veure als plots i al summary, tots quatre models presenten residus amb característiques enenergèticament desfavorables i, si ens fixem bé, veurem que la suma de 'disallowed' i 'generously allowed' (és a dir, el conjunt de residus que són incorrectes o bé correctes amb un dintell d'error massa alt) és bastant simil·lar als quatre. (clu1:2.2%, clu2:1.8%,hmm1:3%, hmm2:2.6%).
No obstant, no és fàcil decantarse per cap dels quatre models, ja que aquell que té un més alt percentatge de residus en el 'core' i menor en disallowed (hmm2) és precissament el mateix que té el major nombre de bad contacts, i el que té el menor nombre de bad contacts és el que té el major percentatge de disallowed.

2-Anàlisi per prosaII

Passem, per tant, a analitzar els nostres models amb prosa:

-Carreguem tots quatre pdb's
-Demanem que ens faci un analisis d'energia (analyse energy *)
-Assignem els colors:
color * hmm1 green
color * hmm2 blue
color * clu1 yellow
color * clu2 red

-Canviem l'amplada de la finestra lliscant: winsize * 50
i grafiquem:
plot
pscolor = 1
export my plot c12h12.ps

Anem a veure els resultats...

Tal com esperàvem, tots quatre models són molt semblants, ja que el nombre de seqüències que vam utilitzar per crear-los era baix. No obstant, es veu a simple vista que són prou estables energèticament, tot i que a partir de l'aa 275 aproximadament, totes les gràfiques d'energia comencen a pujar i a tornar-se energèticament desfavorables.

Obrirem els models amb RasMol i intentarem veure a què es degut...

Tal com es veu a la captura de RasMol, totes les seqüències tenen uns segments llargs i sense estructura secundària que són, de ben segur, resultat de les regions terminals de P11018 que no trobaven homologia. Per arreglar aquest problema, veurem a partir de quin aa comença el problema, i 'retallarem' els models treient aquestes llargues cues del fitxer.
D'acord amb el que veiem a prosa i a RasMol, sembla que a partir de l'aa 300 és cuan comencen els problemes.Analitzant els alineaments, veiem que les regions on P11018 no trobava homologia eren els aa 1-18 i 305-320

Retallant els models
Per fer-ho, obrim el fitxer en mode texte (emacs), i retallem aquells aminoàcids dels extrems que no s'alineaven. Amb els del principi, només cal 'retallar', però a l'hora de treure els del final, cal tenir en compte que el darrer àtom ha de ser un OXT, i ha de tenir unes coordenades coherents amb el anterior àtom. La manera de solucionar-ho es la següent:
Suposem que volem retallar tots aquells residus més enllà del 304. Al pdb, trobem el següent:

ATOM 2254 N   PRO 304 13.233 62.471 24.141 1.00160.46 1SG2255
ATOM 2255 CA PRO 304 13.894 61.675 23.153 1.00160.46 1SG2256
ATOM 2256 CD PRO 304 13.670 61.945 25.423 1.00160.46 1SG2257
ATOM 2257 CB PRO 304 13.854 60.250 23.681 1.00160.46 1SG2258
ATOM 2258 CG PRO 304 14.137 60.494 25.173 1.00160.46 1SG2259
ATOM 2259 C   PRO 304 13.553 61.884 21.718 1.00160.46 1SG2260
ATOM 2260 O   PRO 304 14.419 61.626 20.884 1.00160.46 1SG2261
ATOM 2261 N   ASP 305 12.335 62.335 21.385 1.00 84.18 1SG2262
ATOM 2262 CA ASP 305 12.052 62.563 19.998 1.00 84.18 1SG2263
ATOM 2263 CB ASP 305 10.586 62.907 19.690 1.00 84.18 1SG2264
ATOM 2264 CG ASP 305 9.790 61.612 19.668 1.00 84.18 1SG2265
ATOM 2265 OD1 ASP 305 10.183 60.661 20.394 1.00 84.18 1SG2266
ATOM 2266 OD2 ASP 305 8.779 61.558 18.918 1.00 84.18 1SG2267
ATOM 2267 C   ASP 305 12.884 63.697 19.507 1.00 84.18 1SG2268

Per tancar la proteína al 304, borrem tots els residus posteriors, excepte l'atom inmediatament posterior al O de la PRO 304 (en aquest cas, seria el atom 2261). Substituim N per OXT (és a dir, ara ja no hi ha enllaç peptídic, demanera que en lloc de amino hi haurà l'oxigen del carboxi terminal), i les columnes corresponents a dades del residu 305 les substituim com si fossin del 304, però deixant les coordenades intactes. A la següent linia, afegim un TER o un END per indicar que ja s'ha acabat la proteína, i ja hem tret la part que ens molestava. Quedaria de la següent manera:

Veiem ara com queda a prosaII...

(abans)

(ara)

Tal com es veu comparant totes dues representacions d'energia, retallant els extrems 'no aliniats' de la proteína, hem aconseguit millorar molt el perfil energètic de les estructures (si més no, per els extrems)

En quant a l'avaluació de les estructures, podem concloure que tots quatre models tenen unes gràfiques d'energia prou simil·lars i que cap d'ells arriba a valors positius, de manera que per aquesta banda gairebé podríem acceptar-los tots quatre com mitjanament correctes.

2b-ANALISI PER PROCHECK II
(com hem retocat les estructures al veure les gràfiques a prosaII, tornarem a fer un anàlisi amb procheck de tots quatre models, a veure si milloren una mica els plots...)
(Els plots no s'adjunten ja que són extremadament semblants als anteriors. Només desapareixen aquells residus que estaven 'mal ubicats' i que pertanyien a un dels extrems tallats. Els summaries, en canvi, sí que han variat (han variat els percentatges. Els nous són els següents: peloscortos.sum

Els resultats actuals són:

Model	core	allow	gener	disall	Bad contacts
clustal1.sum	86.3%	11.6%	0.8%	1.2%	6
clustal2.sum	87.6%	10.4%	0.8%	1.2%	8
hmm1.sum	85.9%	11.2%	1.7%	1.2%	7
hmm2.sum	86.7%	10.4%	2.5%	0.4%	7

3-SUPERPOSICIO D'ESTRUCTURES
Utilitzarem STAMP per fer un alineament estructural dels cadascun dels nostres models amb les estructures a partir de les quals els vam crear.
Primer passem PDBtoSplitChain.pl a tots els models.
Creem els fitxers .domain perquè STAMP pugui funcionar, i cridem STAMP:

stamp -l clustal1.domain -rough -n 2 -prefix clustal1
stamp -l clustal2.domain -rough -n 2 -prefix clustal2
stamp -l hmm1.domain -rough -n 2 -prefix hmm1
stamp -l hmm2.domain -rough -n 2 -prefix hmm2

Els valors de RMS i score d'alineament de cadascun dels models, (ordenats per ordre creixent de RMS), són:

hmm1: 0.264700 Sc = 9.294363
hmm2: 0.290252 Sc = 9.273805
clu1: 0.337572 Sc = 9.213210
clu2: 0.398268 Sc = 9.280082

Tal com es veu, tots quatre models presenten un alineament prou bo amb la resta d'estructures de la família (molt inferior a 1), de manera que aquí encara no en podem descartar cap d'ells.

4-Comparació per estructura secundària

L'estratègia que seguirem és la següent:
-Ja que estem tractant amb estructures, i no seqüències -tots els models tenen la mateixa seqüència,després de tot!-, obtindrem, amb dssp, les estructures secundàries de les 4 proteínes amb les que vam construir els models.
-Llavors, les mostrarem en un alíniament (tal com vam fer al principi d'aquesta pràctica) per intentar veure quina s'ajusta més al patró de la família.

dssp clu1.pdb clu1.dssp
dssp clu2.pdb clu2.dssp
dssp hm1.pdb hmm1.dssp
dssp hm2.pdb hmm2.dssp

aliss.pl clu1.dssp > clu1.2nd
aliss.pl clu2.dssp > clu2.2nd
aliss.pl hmm1.dssp > hmm1.2nd
aliss.pl hmm2.dssp > hmm2.2nd

L'alineament d'estructures secundàries, tal com es veu quan les aliniem totes, surt molt semblant a tots quatre models -de nou, el motiu és haver escollit tan poques seqüències per construir els models- , però tot i així ja hi ha alguna diferència que ens permet veure, per exemple, que clustal1 és el que ha conservat més salguns dominis que els altres models han perdut.

5-La tria del model
Com s'ha anat veient, tots quatre models semblen prou aptes, i les diferències dels diferents anàlisis no van -ni molt menys- en direcció a afavorir cap d'ells. No obstant, clustal1 ha mostrat uns resultats mitjos millors a la resta (especialment a ProsaII i a Procheck). El valor obtingut a la RMS de STAMP tampoc és dolent (0.33), així que clustal1.pdb serà el model que triem per a fer la següent i darrera pràctica.

<< >>