Pràctica 7- Optimització d'estructures: GRUMOS
Pràctiques de Biologia Estructural- Carlos Masdeu Ávila- Nia=16965
<<  

1-Introducció

       GROMOS és un software d'optimització d'estructures mitjançant "optimització geomètrica", en el que s'intenten assolir mínims energètics intentant reduir paràmetres com forces de torsió en els angles dels àtoms ,etc.. presents al nostre model, derivades de l'intent de construir una estructura quimèrica a partir de petites parts amb les que, seqüèncialment, hi havia homologia.

       Nosaltres utilitzarem GRUMOS, que és una versió més còmoda d'utilitzar, a fi d'optimitzar el model que vam seleccionar d'entre tots els generats.

       És important que el nostre .pdb input compleixi una sèrie de requisits per al correcte funcionament amb GRUMOS. Per això, primer li passarem un script que arregla els pdb per a grumos, arrangeG.pl. Una altra cosa important de cara a la compatibilitat amb GRUMOS és que el nostre pdb acabi amb una linea en la que només apareix TER.

       Preparat ja el pdb, l'optimitzarem mitjançant GRUMOS...

2-L'interfície GRUMOS

-Primer ens demanarà el fitxer d'entrada i el directori per a crear l'output.

-Triem Input>Topology>simple system

-Ens demana un títol

-Després ens preguntarà si volem canviar el nom d'algun aminoàcid de la nostra seqüència. Això serveix per declarar ponts disulfur, per exemple, en els què les cisteïnes que intervenen en el pont passen a dir-se CYSH o CYS1, CYS2. En el nostre cas, he mirat, mitjançant RasMol, si havia dos cisteines prou properes com per formar un pont disulfur, però les dos cisteínes de la estructura estaven massa lluny com per formar un disulfur. Així, no declararé cap pont disulfur.

-Triem Input>Topology>simple system

-Em pregunta pel solvent,i trio la opció per defecte, <1> Non inertial solvent, NIS model

-Em pregunta per la ionització, i trio la que hi hauria a pH=7

-Llavors correm el procés de Topology (single system)

(després de que GRUMOS donés molts problemes amb el model, he acabat adonant-me que hi havia un error a una de les seqüències utilitzades per a fer el model, i a les isoleucines hi havia un atom que ell deia CD1 quan grumos esperava un CD... al no trobar-lo,creia que li faltava un àtom, i no podia continuar amb el procés. He editat el pdb des de kwrite, substituint tots els àtoms CD1 de les ILE per CD; després de fer-ho, sí que accepta el model, de manera que puc passar al següent pas)

-Ens dirigim ara a Energy Optimization. Primer creem l'input:

-Utilitzarem el procediment d'Steepest Descent, que busca la manera més ràpida d'arribar als mínims energètics

-1000 pasos per cada execució, 10 optimitzacions

-Respecte els valors de Lambda, agafem les opcions per defecte

-No usem SHAKE

-Interaccions per parelles de GRUPS i no d'àtoms

-Value of RCUTP < 0.8 nm> : 0.8

-Value of RSWI2 <10.0 nm> : 99999 (augmentem el valor perquè el radi sigui tan alt que no ho calculi)

-Value of RCUI2 <10.0 nm> : 99999 (idem)

-Value of RCUTL < 1.3 nm> : 1.3

-Sequence radius to calculate the interaction: 999999

-No periodicity, no position restraining, No distance restraining

Un cop creat l'input, ja podem correr el procés:

RUN a process>ENERGY OPTIMITZATION>Single system

El programa queda llavors en background, de manera que si sortim i anem al directori que hem definit per a l'output, veurem com GRUMOS va fent els processos.

3-L'output de GRUMOS

-Dins de la carpeta generada per GRUMOS, trobem una sèrie numerada d'arxius .lis, que són l'informe d'energia a cada iteració. Aquí s'adjunten 3 per poder veure l'evolució:

outclu_emnum001.lis outclu_emnum006.lis outclu_emnum010.lis

(L'evolució del procés es pot veure si anem a la part 3, ATOM COORDINATES, on apareixeran quadres com aquest( s'ha marcat en vermell el nombre que correspon al nombre de Step d'aquella iteració i en groc l'energia potencial total de la proteína en aquest pas):

(Tal com es veu, si es miren el primer pas d'outclu_emnum001.lis i el darrer de outclu_emnum010.lis, l'energia potencial total del sistema passa de 0.12903E+05 a -0.16727E+05)

-GRUMOS també ens genera un altre output, que es troba a la carpeta coordinates dins del directori que hem marcat com a ouput.

-Aquí trobarem també una sèrie d'arxius numerats, però en aquest cas tenen l'extensió .gsf. Corresponen a les coordenades de l'estructura després de cada pas d'optimització, i si els mirem, veurem com el format, tot i que s'assembla al format pdb, no acaba de ser exactament igual (falten les paraules clau ATOM, la divisió en columnes no es igual, etc...)

-El model corresponent a la darrera optimització és copiat, a més del .gsf, amb un altre nom, cluxvmd0000.gsf, però el format continua essent el mateix.

4-Superposant els models optimitzats (XAM)

-A fi de veure l'evolució que ha anat fent el model al llarg de l'steepest descent (i convertir de pas els .gsf en un format .pdb visible amb RasMol), superposem alguns dels models amb XAM. (veure prac4.1)

Tal com es veu, la superposició de tres dels models (corresponents als pasos 1,5 i 10) sembla no revelar gaire diferències entre ells, quan es representa en forma 'cartoon' amb els colors per estructures.

No obstant, si canviem el mode de vista a Wireframe i pintem cada model d'un color, veurem com hi ha petites variacions a gairebé tots els angles entre àtoms (veure requadres grocs).                 Si tenim en compte la gran quantitat d'angles que formen tota l'estructura, podem fer-nos una idea de la millora energètica que pot suposar el sumatori de la contribució energètica de cadascun d'aquests petits angles.

-Fet això, ja podem extreure el nostre model del fitxer de superposició. Basta amb trobar la linea on comenci el darrer dels models, i copiar-ho a un altre arxiu amb el nou nom.

-Un cop hem separat el model optimitzat, podem passar doncs a avaluar-lo.

5-Avaluació del model optimitzat

-Tal com vam fer a la pràctica anterior, utilitzarem els següents programes per avaluar el nostre model:

5.1-Procheck
5.2-Prosa
5.3-Superposició d'estructures
5.4-Psipred/dssp

5.1-Avaluació del model amb Procheck

Ramachandran Plot:

El Ramachandran Plot sembla haver empitjorat: apareixen varis residus a zones 'disallowed', cosa que abans no ocorria, i ha augmentat el nombre de residus situats a les zones 'generously allowed'

Summary: modeloptsuelto.sum

           Comparant amb abans de l'optimització,

          Veiem que hi ha hagut una redistribució de residus en les diferents zones del plot, amb un augment de les zones energèticament més desafavorides en detriment del core. La zona de residus permesos, no obstant, ha augmentat en ocurrències. El canvi més notori és el nombre de bad contacts, que ha estat reduït a zero, fet que millora molt la versemblança del model.

5.2-Avaluació amb ProsaII

          Per a realitzar l'avaluació amb prosaII, graficarem l'energia del model abans i després de l'optimització de GRUMOS.

Afortunadament, l'optimització ha millorat molt el perfil energètic del nostre model, especialment en la vall central. L'extrem NH3 (esquerra de la gràfica) ha vist augmentada lleugerament la seva energia, però continua sent negativa, de manera que no ens preocuparem gaire per aquest fet.

5.3-Superposició d'estructures

         De nou, utilitzarem STAMP per superposar l'estructura amb les homòlogues per veure si ha variat gaire l'alineament estructural amb l'optimització.

         L'output ens indica que el RMS de la superposició del nostre model amb la resta és de 0.61 (bastant més alt que el valor que donava el model abans de passar per grumos, veure resultats de superposició de la prac.6.2), la qual cosa vol dir que, estructuralment, a l'optimitzar energèticament la proteïna ens hem allunyat del 'canon' estructural definit per les 4 proteínes a partir de les quals vam construir el model.

         No ens ha d'extranyar aquest fet, no obstant, ja que al haver-hi tanta petita reordenació espacial, com vam veure a l'analitzar l'evolució del model al llarg de l'optimització, el resultat final és normal que disti molt estructuralment de com era a l'inici.

         Transformem l'output de la superposició en pdb, a fi de veure si aquestes diferències estructurals són només deguts a moltes petites variacions en els angles entre àtoms, o bé hi ha alguna cosa més gran i visible:

	Ja amb la representació en mode 'Cartoon' es veu com el nostre model optimitzat presenta variacions respecte a la resta d'estructures. En la captura s'han senyalat quatre coils que segueixen una trajectoria completament diferent a la que segueixen els homòlegs (la qual és, en tots tres casos, bastant conservada).
	En la representació en mode wireframe veiem com moltes de les cadenes laterals dels residus protueixen cap a l'exterior. Això és degut segurament a què a l'optimització, a fi d'evitar 'bad contacts', es deuen haver mogut aquestes cadenes laterals cap a aquells llocs on tenien menys impediments estèrics (és a dir, en molts dels casos, cap a fora)
	Aquesta captura vé d'un aliniament addicional realitzat afegint la seqüencia no optimitzada. El motiu era comprovar si abans de l'optimització protuïen tant les cadenes laterals cap enfora. Tal com es veu a la imatge, tots dos models (abans de la optimització i després de la optimització) guarden un patró simil·lar en aquest aspecte, de manera que no podem explicar les diferències de RMS només amb aquest fet, sinò que hem de tenir en compte que és el sumatori de molts petits canvis el que ha acabat conformant el augment de RMS.

5.4-Estructura secundària

         Utilitzarem DSSP per obtenir la seqüència secundària del model en format FASTA, i després l'aliniarem amb els altres de la família i amb clustal1.dssp (model triat, abans d'optimitzar) , a fi de valorar el canvi respecte a sí mateix i a la família de proteínes.

          Un cop tenim l'output de dssp per al nostre model, l'aliniem amb la resta, i obtenim opt.aln:

He intentat marcar amb colors les zones en les què el model optimitzat suposa alguna millora clara respecte al no optimitzat(verd) i les què, pel contrari, ha allunyat encara més de l'estructura de la família.        Tal com vam veure amb la superposició estructural, l'optimització també ha allunyat en aquest aspecte el model de les estructures a partir de les quals va ser creat

Conclusions respecte l'optimització

             L'optimització ha fet més estable el nostre model, però a expenses d'allunyar-lo del patró estructural que marcaven els homòlegs a partir del quals vam construir-lo. Això es deu sobretot al fet què hi havia massa residus en "Bad Contact" o bé amb angles que no els feien ser 'allowed'. En conseqüència, la optimització energètica ha estat més pronunciada, i s'han hagut de variar molt més les estructures a fi de poder aconseguir uns mínims energètics, i ha estat en aquest procés que les estructures s'han vist afectades.

<<