MODEL DEFINITIU

CONSTRUCCIÓ DEL MODEL DEFINITIU

El model estructural definitiu es va construir amb: ht0B, axeA, kevC, ykfD.

Els pdbs de les proteïnes template es van alinear estructuralment amb STAMP, l’arxiu obtingut es transformà a format clustalw i després a format sp per visualitzar-lo al Rasmol .

A partir del fitxer obtingut amb el Stamp modificat s’utilitzà per fer una matriu HMMER (build, calibrate i align) per trobar un perfil estructural de les ADH, a partir de les homòlogues finalment escollides, que llençàrem contra la seqüència ALCEU. Aquest fitxer s’havia de transformar a format clustalw i després a format pir per poder-lo introduir en el programa modeller .

El programa MODELLER llegeix un arxiu top on s’especifica la seqüència problema, els templates en format pdb i el fitxer en format pir per tal d’obtenir el model estructural de la proteïna alceu.

Es van generar 15 models dels quals es va analitzar l’energia amb el PROSA i se’n van escollir els dos millors (alceu1 i 4), aquests tenien una energia de 0.05 i 0.1.

I els millors models també van ser visualitzats amb RASMOL per saber l’estructura secundària de la regió del loop definitiva: alceu 1 tenia 2a i 2b, i alceu 4 tenia 2a i 3b (1 és d’un residu). (noualceu1est i noualceu4)

Finalment, aquests models es van analitzar amb el programa PROCHECK que edita uns mapes de Ramachandran (format sp) i un fitxer (format sum), on s’especifica els residus afavorits (core), permesos (allowed), generosament permesos (gener), no permesos (disallowed) i bad contacts. Els resultats van ser:

- ALCEU 1: core (88.9%), allowed (9.8%), gener (1.8%), disallowed (0.3%) i bad contacts (8). (ALCEUest.sum) (alceuest01.ps)

- ALCEU 4: core (87.2%), allowed (9.8%), gener (2.6%), disallowed (0.3%) i bad contacts (8). (ALCEUsum) (alceu01.ps)

Es va comprovar quants d’aquests residus no permesos pertanyien a la regió del loop que tenia energia positiva i quina estructura hi havia en aquesta regió. Aquests residus eren:

- alceu 1: gln105 (alfa), leu110 (loop), ser113 (no especificat), gly114 (no especificat), ala125 (beta)

- alceu 4: leu110 (loop), ser113 (no especificat), ala125 (no especificat, a l’extrem d’una beta), asn131 (loop)

Els residus leu110, ser113 i ala125 coincidien en tots dos models perquè deurien ser els pitjor modelats de la regió del loop.

OPTIMITZACIÓ

L’optimització es va dur a terme amb el programa GRUMOS.

En un pas previ es va analitzar si les cisteïnes (cys) dels models feien ponts disulfur mitjançant el programa VMD. Les distàncies mesurades entre les cisteïnes eren superiors a 2.5 – 2.8, per tant, no es pot considerar que es formin ponts disulfur entre les nou cisteïnes de la seqüència.

Llavors es va fer l’optimització d’energia pels dos millors models (alceu1 i 4). Les característiques més importants van ser:

- sense ponts disulfur, perquè les cisteïnes estaven massa separades entre elles

- sense aigua, per facilitar l’anàlisi, encara que el modelatge amb aigua hagués estat més real perquè la proteïna sempre està en solució

- sense periodicitat, perquè no es tractava un cristall cristal·logràfic

- sense restriccions de distàncies, de dihedral ni de posició

El primer i l’últim arxiu (format gsf) optimitzats de cada model es van superposar amb el XAM per veure si hi havia diferències estructurals i obtenir un arxiu pdb amb tots dos.

Degut a que l’últim arxiu gsf de cada model és el més optimitzat, es va escollir aquest per analitzar l’energia amb el PROSA comparant-los amb el model abans d’optimitzar (alceu1 i 4). En el model optimitzat d’alceu 4 l’energia arribava a zero i en el d’alceu 1 l’energia tenia valors negatius (alceu1i4opt).

Finalment es compararen el millor model optimitzat (alceu1opt) amb el mateix model sense optimitzar (alceu1) i amb el template kev que s’utilitzarà per fer el model d’alceu amb cofators (sessiontotdefcmd), veure l’apartat Construcció de models amb cofactors.

Finalment, aquests models es van analitzar amb el programa PROCHECK per visualitzar amb el programa GHOSTVIEW els mapes de Ramachandran (format sp) i un fitxer (format sum), on s’especifica els residus afavorits (core), permesos (allowed), generosament permesos (gener), no permesos (disallowed) i bad contacts. Els resultats van ser:

- ALCEU1 optimitzat: core (78.4%), allowed (19.3%), gener (1.3%), disallowed (1.0%) i bad contacts (0). (alceuopt1.sum) (alceu1op.ps)

- ALCEU4 optimitzat: core (75.4%), allowed (21.3%), gener (1.6%), disallowed (1.6%) i bad contacts (0). (alceu4op.sum) (alceu4op.ps)

Amb l’optimització, encara i disminuir els residus favorables i augmentar els desfavorables, van disminuir els bad contacts a zero, que era el que es volia aconseguir, ja que els residus en posició desfavorable s’espera que disminueixin amb la dinàmica.

L’alceu 1 optimitzat tenia energia menor i millors tants per cents en els residus disallowed i en el core, que alceu 4 optimitzat. Per tant, es va escollir l’ alceu1 com a model definitiu.

DINÀMICA

Es va fer la dinàmica del model alceu 1 optimitzat amb el programa GRUMOS.

Les característiques més importants van ser:

- amb SHAKE per constrenyir distàncies

- sense restricció de posició, distància o dihedral

Seguidament es realitzà l’anàlisi dels 10 fitxers (format hs) i els 10 fitxer (format gsf) es van superposar amb el XAM per obtenir un fitxer pdb amb tots els models de la dinàmica.

Mitjançant el PROSA es va analitzar l’energia d’aquestes noves conformacions. El patró d’energia mostrava una fluctuació d’energia en la regió del loop sent major de cero en algunes conformacions i menor de cero en altres (sessionmd.cmd). No es pot dir que en la regió del loop, la conformació adoptada amb menys energia sigui més estable perquè no se sap en quines condicions és més estable la proteïna alceu. En les altres regions la proteïna està molt conservada.

B-FACTOR

L’opció B-factor dins del programa GRUMOS permet veure la fluctuació de l’estructura segons la temperatura d’anàlisi. La temperatura està directament relacionada amb la velocitat de moviment dels àtoms, les regions amb alta temperatura són aquelles que fluctuen més.

Es van analitzar els resultats obtinguts en el B-Factor: (bfactorpics)

· El pic de 289-300 corresponia a un tros del plegament Rossman del model alceu. Les estructures trobades en aquests aminoàcids eren un tros de beta trencada, un tros de loop i un d’hèlix alfa. En aquesta regió hauria d’haver-hi una beta del plegament Rossman implicada en el domini de dimerització, per tant, el modelatge no és del tot correcte.

· El pic de 243-255 també pertanyien al mateix tipus de plegament on s’observava una hèlix alfa trencada.

· El pic de 100-110 pertanyia a una cadena beta mal modelada que no se sap a quina estructura ha de correspondre realment ja que ha estat impossible modelar la regió del residu 90-130 (analisiloop)

· El pic de 49-57 corresponia a un tros de loop, una beta d’un residu i un tros no especificat. Se suposa que aquesta regió hauria de correspondre a una regió de loop.