PART 1: XAM
  1. DESCRIPCIÓ TEÒRICA DEL PROGRAMA


    En la primera part de la pràctica, utilitzarem el programa XAM, per a realitzar aliniaments estructurals entre les diferents proteïnes analitzades.

    XAM és un programa dŽaliniament estructural que realitza una superposició de dues proteïnes tot realitzant tant moviments de rotació (per a encaixar les estructures) com moviments de translació (mou les estructures fins a superposar-les).

    Aquest programa tracta de comparar cada un dels residus dŽuna estructura amb els residus de lŽaltra (per exemple, agafa el residu 1 de la cadena A i el compara amb el primer residu de la cadena B, igual amb el residu 2...), per tal dŽintentar trobar identitat entre ambdues. LŽordre dels diferents àtoms que pren per a cada estructura, és lŽordre existent en el seu corresponent arxiu .pdb.

    De la comparació dels diferents residus seŽn calcula un valor de RMSD (Root Mean Square Deviation function), que ens ve a indicar com de semblants són dues estructures.


  2. DESCRIPCIÓ PRÀCTICA DELS COMANDAMENTS DEL PROGRAMA I EXEMPLES DE COMANDAMENTS I CONDICIONS APLICADES EN LŽEXECUCIÓ


    Les comandes utilitzades durant aquesta part de la pràctica, han estat:

    $ cp /disc9/practica_4/XAM .
    $ cd XAM
    $ ls

    helix1.pdb
    helix2.pdb
    helix3.pdb
    helix4.pdb ...


    Un cop executades aquestes ordres, es tracta dŽanalitzar lŽestructura, el nombre de residus i demés característiques de les quatre hèlixs donades com a exemple, per a finalment arribar a lŽexecució del programa de superposició dŽestructures en qüestió (xam).

    Una comanda interessant per a conèixer el nombre de residus dŽuna determinada proteïna, és:

    $ grep CA helix4.pdb > comandanumresidus

    I lŽarxiu de sortida (comandanumresidus), mostrarà només els carbonis α de lŽarxiu helix4.pdb: 


    ATOM      2  CA  ARG     1     -10.776 208.517  81.308
ATOM     13  CA  ALA     2     -10.322 209.753  77.707
ATOM     18  CA  ILE     3      -6.946 208.110  77.497
ATOM     26  CA  LEU     4      -8.694 205.023  78.799
ATOM     34  CA  VAL     5     -11.632 204.919  76.373
ATOM     41  CA  ASP     6      -9.258 205.640  73.481
ATOM     49  CA  TRP     7      -7.138 202.576  74.472
ATOM     63  CA  LEU     8     -10.328 200.516  74.574
ATOM     71  CA  VAL     9     -11.030 201.504  70.957
ATOM     78  CA  GLU    10      -7.584 200.169  70.066
ATOM     87  CA  VAL    11      -8.041 196.955  72.054
ATOM     94  CA  GLY    12     -11.304 196.522  70.174
ATOM     98  CA  GLU    13      -9.627 196.947  66.770
ATOM    107  CA  GLU    14      -6.766 194.607  67.704


    Ara passarem a executar el programa i estudiar-ne les seves possibles aplicacions. Com a exemple, realitzarem la superposició estructural entre lŽhelix3.pdb i lŽhelix4.pdb (tenen igual nombre de residus).


    [e14910.bio.acexs.au.upf@au48239 practica_4]$ /disc9/Superposition/xam/xam
    	
 Output file name                            : output_3_4
 Input file list? or (cr)                    :
 Structure   1 or (cr) : helix3.pdb
 Structure   2 or (cr) : helix4.pdb
 Structure   3 or (cr) :
 Open file:
 helix3.pdb
 ATOM      1  N   LYS     1     -30.968 220.204  69.410
 Total residues:  14 total atoms:  115 in structure:   1
 Open file:
 helix4.pdb
 ATOM      1  N   ARG     1      -9.673 209.345  81.811
 Total residues:  14 total atoms:  115 in structure:   2
 Total molecules:   2 total groups:   1
 
    All mole. are the same type
    , if OK, (cr):

 1=RMSD, 2=HBTAB, 3=VIOLAT, 4=ANGDIS, 5=DISPLAY, 6=READML,
 7=SURFACE_NO_ATOM, 8=SURFACE_WITH_ATOM,
 9=RADIUS_OF_GYRATION, 10=RINGSHIFT, 0=STOP: 1
 Backbone atoms: N,CA,C,P,O5',C5',C4',C3',O3'
 BB atoms are listed above, if yes (cr)      :
 Cyclopeptide? default is not, if OK (cr)    :
 RMSD of 1st str. to the rest? default is not:
 Output file for superimposed struc.? or (cr):
 Output file for mean structure? or (cr)     :
 Fragments for superposition, (default: all)
 first & last residue of frag.  1:
 Selected residues for SC? filename or (cr):

		[...]

 1=RMSD, 2=HBTAB, 3=VIOLAT, 4=ANGDIS, 5=DISPLAY, 6=READML,
 7=SURFACE_NO_ATOM, 8=SURFACE_WITH_ATOM,
 9=RADIUS_OF_GYRATION, 10=RINGSHIFT, 0=STOP: 1
 Backbone atoms: N,CA,C,P,O5',C5',C4',C3',O3'
 BB atoms are listed above, if yes (cr)      :
 Cyclopeptide? default is not, if OK (cr)    :
 RMSD of 1st str. to the rest? default is not:
 Output file for superimposed struc.? or (cr): helix_3_4.pdb
 Output fmt 1=DG,2=PDB,3=AMBER,4=bPDB,5=GSF,(cr)=DG 4
 Key words (4 lettes, e.g., 5PTI) :
 A (all atoms) or S (superimposed)? (cr)=A
 Output for BB or Heavy superim.? B/H (cr)=B
 Output file for mean structure? or (cr)     :
 Fragments for superposition, (default: all)
 first & last residue of frag.  1:
 Selected residues for SC? filename or (cr):

		[...]

 1=RMSD, 2=HBTAB, 3=VIOLAT, 4=ANGDIS, 5=DISPLAY, 6=READML,
 7=SURFACE_NO_ATOM, 8=SURFACE_WITH_ATOM,
 9=RADIUS_OF_GYRATION, 10=RINGSHIFT, 0=STOP: 0
STOP Oh, XAM! statement executed

    Un cop executat el programa, resulten dos arxius de sortida: un arxiu .pdb (mostra les dues estructures superposades visualment) i lŽaltre, el valor de RMSD (indica com de bo és aquest aliniament). Tot clicant els annexes següents, comprovaràs els resultats obtinguts amb lŽactual exemple: helix_3_4.pdb i output_3_4

    Cal tenir en compte la longitud dels residus a superposar, ja que si aquesta llargada difereix entre les diferents estructures a comparar, llavors el programa dóna errors. Més endavant, ja veurem alguns exemples...


  3. RESULTATS OBTINGUTS DE LŽAPLICACIÓ DEL PROGRAMA ALS EXEMPLES COMENTATS I PROBLEMES PROPOSATS A LA PRÀCTICA


    • Calcula el millor RMSD entre les estructures de les hèlixs 1,2,3 i 4. Quins són els intèrvals de residus més adequats per tal dŽobtenir el millor aliniament estructural?.


      En aquest cas, executarem de nou el programa XAM, però ara caldrà tenir especial cura del nombre de residus de les diferents estructures a aliniar:


      helix1.pdb= 23 residus
      helix2.pdb= 18 residus
      helix3.pdb= 14 residus
      helix4.pdb= 14 residus


      Val a dir que els resultats que es mostren a continuació són els millors obtinguts dŽentre les diferents proves realitzades, per tal dŽobtenir el millor RMSD tot agafant el major nombre de residus compartits entre les diferents estructures.

      ... de nou lŽexecució del programa, mostra:


      [e14910.bio.acexs.au.upf@au48239 practica_4]$ /disc9/Superposition/xam/xam
       Output file name                            : totesquatre
 Input file list? or (cr)                    :
 Structure   1 or (cr) : helix1.pdb
 Structure   2 or (cr) : helix2.pdb
 Structure   3 or (cr) : helix3.pdb
 Structure   4 or (cr) : helix4.pdb
 Structure   5 or (cr) :
 Open file:
 helix1.pdb
 REMARK TITLE
 Total residues:  23 total atoms:  199 in structure:   1
 Open file:
 helix2.pdb
 ATOM    304  N   SER    37      -9.461 213.395  81.694
 Total residues:  18 total atoms:  150 in structure:   2
 Open file:
 helix3.pdb
 ATOM      1  N   LYS     1     -30.968 220.204  69.410
 Total residues:  14 total atoms:  115 in structure:   3
 Open file:
 helix4.pdb
 ATOM      1  N   ARG     1      -9.673 209.345  81.811
 Total residues:  14 total atoms:  115 in structure:   4
 Total molecules:   4 total groups:   1

 1=RMSD, 2=HBTAB, 3=VIOLAT, 4=ANGDIS, 5=DISPLAY, 6=READML,
 7=SURFACE_NO_ATOM, 8=SURFACE_WITH_ATOM,
 9=RADIUS_OF_GYRATION, 10=RINGSHIFT, 0=STOP: 1
 Backbone atoms: N,CA,C,P,O5',C5',C4',C3',O3'
 BB atoms are listed above, if yes (cr)      :
 Cyclopeptide? default is not, if OK (cr)    :
 RMSD of 1st str. to the rest? default is not:
 Output file for superimposed struc.? or (cr):
 Output file for mean structure? or (cr)     :
 Fragments for superposition, (default: all)
 first & last residue of frag.  1: 7 17
 first & last residue of frag.  2:
 Selected residues for SC? filename or (cr):
 Molecule  2 has different length!
 If the fragments for superimp. are different, give the ranges, otherwise (cr)
 first & last residue of frag.  1: 39 49
 first & last residue of frag.  2:
 Molecule  3 has different length!
 If the fragments for superimp. are different, give the ranges, otherwise (cr)
 first & last residue of frag.  1: 3 13
 first & last residue of frag.  2:
 Molecule  4 has different length!
 If the fragments for superimp. are different, give the ranges, otherwise (cr)
 first & last residue of frag.  1: 3 13
 first & last residue of frag.  2:
 
      Atom order not checked, because of different molecular 
      lengthes or identifying 
 atoms to be displayed!
      
 Atom order not checked, because of different molecular 
      lengthes or identifying
 atoms to be displayed!
      
 Warning: no calculations for heavy atoms, its number not equal in molecule  2

 1=RMSD, 2=HBTAB, 3=VIOLAT, 4=ANGDIS, 5=DISPLAY, 6=READML,
 7=SURFACE_NO_ATOM, 8=SURFACE_WITH_ATOM,
 9=RADIUS_OF_GYRATION, 10=RINGSHIFT, 0=STOP: 1
 Backbone atoms: N,CA,C,P,O5',C5',C4',C3',O3'
 BB atoms are listed above, if yes (cr)      :
 Cyclopeptide? default is not, if OK (cr)    :
 RMSD of 1st str. to the rest? default is not:
 Output file for superimposed struc.? or (cr): totesquatre.pdb
 Output fmt 1=DG,2=PDB,3=AMBER,4=bPDB,5=GSF,=DG 4
 Key words (4 lettes, e.g., 5PTI) :
 A (all atoms) or S (superimposed)? (cr)=A
 Output for BB or Heavy superim.? B/H (cr)=B
 Output file for mean structure? or (cr)     :
 Fragments for superposition, (default: all)
 first & last residue of frag.  1: 7 17
 first & last residue of frag.  2:
 Selected residues for SC? filename or (cr):
 Molecule  2 has different length!
 If the fragments for superimp. are different, give the ranges, otherwise (cr)
 first & last residue of frag.  1: 39 49
 first & last residue of frag.  2:
 Molecule  3 has different length!
 If the fragments for superimp. are different, give the ranges, otherwise (cr)
 first & last residue of frag.  1: 3 13
 first & last residue of frag.  2:
 Molecule  4 has different length!
 If the fragments for superimp. are different, give the ranges, otherwise (cr)
 first & last residue of frag.  1: 3 13
 first & last residue of frag.  2:

       Atom order not checked, because of different molecular 
      lengthes or identifying 
 atoms to be displayed!
      
 Atom order not checked, because of different molecular 
      lengthes or identifying 
 atoms to be displayed!
      
 Atom order not checked, because of different molecular 
      lengthes or identifying 
 atoms to be displayed!
      
 Atom order not checked, because of different molecular 
      lengthes or identifying 
 atoms to be displayed!
      
 Atom order not checked, because of different molecular 
      lengthes or identifying 
 atoms to be displayed!
      

 1=RMSD, 2=HBTAB, 3=VIOLAT, 4=ANGDIS, 5=DISPLAY, 6=READML,
 7=SURFACE_NO_ATOM, 8=SURFACE_WITH_ATOM,
 9=RADIUS_OF_GYRATION, 10=RINGSHIFT, 0=STOP: 0
STOP Oh, XAM! statement executed


      Un cop més, després dŽexecutar el programa, es generen dos arxius de sortida: totesquatre i totesquatre.pdb

      Així doncs, el nombre més gran de residus que he pogut utilitzar per tal que el valor de RMSD sigui el més petit possible, ha estat de 11 residus. Els diferents valors de RMSD, entre les diferents hèlixs, es troba per sota del límit que es considera acceptable (< 2Å).


    • Fes una comparació estructural de dos plegaments globin-like de la mateixa família de SCOP, amb el programa XAM.


      Els passos que he seguit per tal dŽescollir les diferents proteïnes globin-like i després analitzar-les, ha estat:


      1. Anar a la pàgina dŽSCOP (SCOP!)
      2. Triar lŽopció de "Top of the Hierarchy"
      3. Triar "all alpha proteins"
      4. Triar "globin like"
      5. Triar Superfamília: Globin like
      6. Triar Família: Globins
      7. Escollir dŽentre les diferents espècies tant similars (Myoglobin,Hemoglobin ...)


      Un cop he escollit les proteïnes de les diferents espècies amb què vull treballar, descarrego cada una de les diferents estructures en format .pdb (des de la pàgina de PDB, per exemple).

      A continuació, sobre cada una dŽaquestes estructures triades, executo la comanda...:

      $ perl /disc9/PERL/PDBtoSplitChain.pl -i nompdb.ent -o nompdb

      ... per tal de separar les diferents subcadenes que fomen cada una dŽaquestes estructures.

      Finalment, les estructures que trio per a fer lŽaliniament estructural, són:

      Human: 2mm1.ent
      Whale: 1a6m.ent

      Per a aquesta pràctica, realitzo tant un aliniament estructural (XAM), com un aliniament de seqüències (Clustalw). Com ja hem vist les diferents comandes per a lŽexecució de cadascun dels programes, directament, analitzarem els resultats.

      LŽexecució de XAM, mostra dos arxius, human_whale i human_whale.pdb, mentre que de lŽexecució de la comanda de Clustalw, nŽobtenim el següent aliniament: human_whale.aln a partir dŽun arxiu que conté les seqüències en format fasta (human_whale.fa)

      El resultat obtingut és força similar en ambdós casos: tant lŽaliniament estructural com el de seqüència ens estan indicant que les dues seqüències són molt semblants (lŽaliniament de Clustalw és molt bo) i que la seva estructura es conserva (lŽestructura se superposa quasi a la perfecció).



PART 2: STAMP
  1. DESCRIPCIÓ TEÒRICA DEL PROGRAMA


    En aquesta part de la pràctica emprarem un programa dŽaliniament estructural (similar a XAM), però que en aquest cas utilitza lŽalgorisme dŽSmith-Waterman (SW) per tal de determinar lŽaliniament més ràpid existent entre les diferents estructures donades.

    A diferència de lŽanterior programa, STAMP, no necessita lŽentrada dŽun interval de la seqüència a superposar, sinó que partint de les estructures (arxiu .pdb) nŽobté lŽaliniament global òptim.


  2. DESCRIPCIÓ PRÀCTICA DELS COMANDAMENTS DEL PROGRAMA I EXEMPLES DE COMANDAMENTS I CONDICIONS APLICADES EN LŽEXECUCIÓ


    Un cop obtinguts els resultats de lŽaliniament estructural entre les diferents globines en lŽapartat 4.1, amb XAM, ara aplicarem un aliniament estructural amb el programa STAMP i tractarem de comparar els diferents resultats que se nŽobtenen.

    Les diferents comandes utilitzades per tal dŽexecutar el programa, són:

    [e14910.bio.acexs.au.upf@au48239 practica_4]$ cp /disc9/practica_4/STAMP/EXAMPLES/globin.tar .
    Copiem la carpeta globin.tar en el nostre directori.
    [e14910.bio.acexs.au.upf@au48239 practica_4]$ tar xvf globin
    Desagrupem el directori .tar, per tal de poder-lo utilitzar.
    [e14910.bio.acexs.au.upf@au48239 practica_4]$ cd globin
    [e14910.bio.acexs.au.upf@au48239 practica_4]$ kwrite globin.domains
    Editem un arxiu que presenti el format dŽentrada dels .pdb, tal i com ho mostra lŽarxiu de sortida adjunt.
    [e14910.bio.acexs.au.upf@au48239 practica_4]$ stamp -l globin.domains -rough -n 2 -prefix globin > stampglobin
    Amb aquesta comanda, fem correr el programa STAMP donant com arxiu dŽentrada: globin.domains. De lŽexecució del programa, resulten diferents arxius de sortida: globin.X (on X, és el nombre menys 1 de les seqüències emprades en lŽarxiu dŽentrada)
    [e14910.bio.acexs.au.upf@au48239 practica_4]$ aconvertMod2.pl -in b -out c < globin.5 > aconvertglobin
    Converteix un aliniament en format STAMP a un aliniament en format Clustalw. LŽopció -in b -out c, dennota el pas de BLOCK (format de sortida propi de lŽSTAMP) a CLUSTAL (format comú de lŽaliniament de seqüències). Aquesta comanda és la forma de mostrar lŽaliniament de sortida de lŽSTAMP en un format vertical.
    [e14910.bio.acexs.au.upf@au48239 practica_4]$ transform -f globin.5 -g -o globin.5.pdb
    Aquesta comanda transforma un arxiu de sortida dŽun programa determinat (dŽSTAMP, ALIGNFIT o SORTRANS) en un arxiu .pdb. LŽarxiu resultant contindrà totes les coordenades específiques transformades en un format definit.

    LŽopció -f, indica lŽarxiu a transformar; lŽopció -g, agrupa totes les coordenades transformades en un sol arxiu .pdb per tal de facilitar-ne la visualització en Rasmol; lŽopció -o, determina el nom de lŽarxiu de sortida.

    [e14910.bio.acexs.au.upf@au48239 practica_4]$ rasmol globin.5.pdb
    Visualització de la superposició resultant, tot utilitzant el programa Rasmol.


  3. RESULTATS OBTINGUTS DE LŽAPLICACIÓ DEL PROGRAMA ALS EXEMPLES COMENTATS I PROBLEMES PROPOSATS A LA PRÀCTICA


    • Escull un plegament β-propeller i fes la superposició dels membres de la família, superfamília i el plegament.

      Per tal dŽexecutar el programa STAMP, obtinc les diferents estructures a utilitzar a partir de lŽSCOP i de PDB.

      Els passos que he seguit per tal dŽescollir les diferents proteïnes β-propeller like i després analitzar-les, ha estat:


      1. Anar a la pàgina dŽSCOP (SCOP!)
      2. Triar lŽopció de "Top of the Hierarchy"
      3. Triar "all beta proteins"
      4. Triar "7-bladed beta-propeller"
      5. Triar Superfamília: Quinoprotein amine dehydrogenase catalytic subunit i RCC1/BLIP-II
      6. Triar Família: per a la primera Superfamília, Methylamine dehydrogenase, H-chain i Quinohemoprotein amine dehydrogenase B chain i per a la segona Superfamília, Regulator of chromosome condensation RCC1 i of beta-lactamase inhibitor protein-II, BLIP-II.
      7. Escollir només dues espècies per a cada Família: 2mta i 1jju, per a la primera Família; 1a12 i 1jtd, per a la segona Família.


      ... ara lŽexecució del programa:

      [e14910.bio.acexs.au.upf@au48239 practica_4]$ kwrite bpropeller.domains
      [e14910.bio.acexs.au.upf@au48239 practica_4]$ stamp -l bpropeller.domains -rough -n 2 -prefix bpropeller > stampbpropeller
      [e14910.bio.acexs.au.upf@au48239 practica_4]$ aconvertMod2.pl -in b -out c < bpropeller.3 > aconvertbpropeller
      [e14910.bio.acexs.au.upf@au48239 practica_4]$ transform -f bpropeller.3 -g -o bpropeller.3.pdb
      [e14910.bio.acexs.au.upf@au48239 practica_4]$ rasmol bpropeller.3.pdb