1. INTRODUCCIÓ A LA PRÀCTICA


    Degut a que aquesta pràctica és força llarga i inclou lŽexecució de gran nombre de comandes així com de diferents programes, distribuiré la pràctica de la següent manera: en primer lloc, a mode dŽintroducció de les diferents comandes, utilitzaré els arxius fets a classe com a exemple.

    Un cop executades les comandes fins a obtenir un model, passaré a comentar el que jo mateixa he obtingut.


  2. COMANDES BÀSIQUES EMPRADES I PROGRAMES UTILITZATS


    Totes les comandes bàsiques utilitzades al llarg de la pràctica a mode de resum, són:


    PART 1: PSI-Blast i Clustalw


    En primer lloc, busco lŽentrada corresponent a P11018 (subtilisin) a GenBank.

    Edito un arxiu que contingui la seqüència en format fasta.

    A continuació inicio la cerca en les diferents bases de dades (en aquest cas: PSI-Blast):

    [e14910.bio.acexs.au.upf@au48239 practica5_1]$ /disc9/BLAST/EXE/blastpgp -i P11018.fa -d /disc9/DB/blast/swissprot -j 2 -C P11018.bls1 -o P11018.out
    [e14910.bio.acexs.au.upf@au48239 practica5_1]$ /disc9/BLAST/EXE/blastpgp -i P11018.fa -d /disc9/DB/blast/pdb -j 2 -R P11018.bls1 -C P11018.bls2 -j 2 -o P11018.out2

    Un cop executades les comandes anteriors, dŽentre els resultats obtinguts, escullo de 2 a 8 seqüències homòlogues a la subtilisin. A continuació descarregaré lŽestructura (format .pdb) de cada una dŽelles així com la seqüència en format fasta.

    A partir de les seqüències trobades en format fasta, creo un arxiu que les contingui totes (llista.fa)

    Tot seguit, executo el programa dŽaliniament de seqüències, Clustalw i el resultat que nŽobtinc és: llista.aln.


    PART 2: STAMP i HMMER


    En aquest apartat ens centrarem en lŽaliniament estructural dels diferents arxius .pdb utilitzats en lŽapartat anterior.

    Després de lŽaliniament estructural, crearem un perfil HMM a partir del paquet de programes continguts en HMMER.

    Les diferents comandes utilitzades han estat:

    [e14910.bio.acexs.au.upf@au48239 practica5_2]$ kwrite pract5_2.domains
    [e14910.bio.acexs.au.upf@au48239 practica5_2]$ stamp -l pract5_2.domains -rough -n 2 -prefix pract5_2 > stamppract5_2
    [e14910.bio.acexs.au.upf@au48239 practica5_2]$ aconvertMod2.pl -in b -out c < pract5_2.3 > pract5_2.3.aln
    [e14910.bio.acexs.au.upf@au48239 practica5_2]$ transform -f pract5_2.3 -g -o pract5_2.3.pdb
    [e14910.bio.acexs.au.upf@au48239 practica5_2]$ rasmol pract5_2.3.pdb


    Ara realitzo modificacions sobre lŽarxiu pract5_2.3.aln (li trec tot asterisc o caràcter rar) i el converteixo en: pract5_2.32.aln.

    Un cop modificat lŽarxiu, ja podré correr el programa per a la construcció dŽHMM, hmmbuild.

    [e14910.bio.acexs.au.upf@au48239 practica5_2]$ hmmbuild pract5_2.hmm pract5_2.32.aln

    Ara creo un arxiu que contingui aquelles seqüències dels .pdb utilitzats per a fer l ŽSTAMP i a més li afegirem la seqüència problema (P11018.fa), abans no inclosa entre la llista de .pdb (és obvi ja que la subtilisin no ha estat cristalitzada encara). LŽarxiu resultant (alinia.fa), el correrem amb lŽopció:

    [e14910.bio.acexs.au.upf@au48239 practica5_2]$ hmmalign -o alinia.aln pract5_2.hmm alinia.fa


    PART 3: MODELLER


    Ara, el que farem és construir un model a partir dels aliniaments de les pràctiques 5.1 (Clustalw) i 5.2 (hmmalign), amb el programa MODELLER.

    Les comandes bàsiques utlitzades han estat:

    [e14910.bio.acexs.au.upf@au48239 practica5_3]$ PDBtoSplitChain.pl -i nomPDB.ent -o nomPDB
    Comanda que separa les subcadenes contingudes en un arxiu .pdb i les guarda en arxius separats (per exemple una proteïna que té 4 cadenes i de lŽexecució dŽaquesta comanda en resultaran quatre arxius: nompdbA, nompdbB, nompdbC i nompdbD)
    [e14910.bio.acexs.au.upf@au48239 practica5_3]$ aconvertMod2.pl -in c -out p < llista2.aln > llista2.ali
    Aquesta comanda només és vàlida per als resultats obtinguts en lŽapartat 5.1. LŽopció -in c, fa referència al format introduït, Clustalw.
    [e14910.bio.acexs.au.upf@au48239 practica5_3]$ aconvertMod2.pl -in h -out p < alinia2.aln > alinia2.ali
    Aquesta comanda només és vàlida per als resultats obtinguts en lŽapartat 5.2. LŽopció -in h, fa referència al format introduït, HMM.

    Després de realitzar el passos anteriors, podem passar a configurar lŽarxiu dŽentrada (nomarxiu.top) al programa MODELLER. En aquest cas, ja que es tracta dŽun exemple, deixarem lŽarxiu tal qual i correrem el programa. Més tard sí el modificarem per a mostrar els models obtinguts.

    Per a visualitzar lŽarxiu:

    [e14910.bio.acexs.au.upf@au48239 practica5_3]$ kwrtie p7.top

    I lŽarxiu mostra... 


    # PRIMER: STEP 5
#
# This script should produce two models, 1fdx.B999901 and 1fdx.B999902.
# 
# Before you run this script, do this: ln alignment.seg.ali fer2.ali
#

INCLUDE                             # Include the predefined TOP routines


SET ALNFILE  = 'p7.ali'             # alignment filename
SET KNOWNS   = '1scjA' '1sbh'       # codes of the templates
SET SEQUENCE = 'P11018'             # code of the target
SET ATOM_FILES_DIRECTORY = './'     # directories for input atom files
SET STARTING_MODEL= 1               # index of the first model 
SET ENDING_MODEL  = 2               # index of the last model
                                    # (determines how many models to calculate)
SET DEVIATION     = 2.0             # have to be >0 if more than 1 model
SET RAND_SEED     = -12312          # to have different models from another TOP file

CALL ROUTINE = 'model'              # do homology modelling

    ... i de lŽexecució del programa...:

    [e14910.bio.acexs.au.upf@au48239 practica5_3]$ mod p7.top

    ... en resulten diversos arxius dŽentre els què seŽn destaquen dos:

    P11018.B99990001
    P11018.B99990002

    Val a dir que lŽexecució del programa MODELLER sempre genera els mateixos arxius de sortida (xxx.B99990001 i xxx.B99990002), així doncs és convenient modificar-ne el nom:

    [e14910.bio.acexs.au.upf@au48239 practica5_3]$ mv P11018.B99990001 P11018pdb1.ent
    [e14910.bio.acexs.au.upf@au48239 practica5_3]$ rasmol P11018pdb1.ent
    [e14910.bio.acexs.au.upf@au48239 practica5_3]$ mv P11018.B99990002 P11018pdb2.ent
    [e14910.bio.acexs.au.upf@au48239 practica5_3]$ rasmol P11018pdb2.ent


    PART 4: PROCHECK


    Un cop hem obtingut els models, podem passar a examinar la seva estructura...

    LŽexecució de la comanda PROCHECK, genera molts arxius de sortida. Ara ens detindrem a comprovar què conté cadascun dŽells:

    [e14910.bio.acexs.au.upf@au48239 practica5_4]$ procheck_single nompdb.ent resolució

    Per a cada model el nompdb.ent serà diferent (hi hem dŽintroduir el nom del model que haguem triat) i segons les estructures emprades en cada cas, haurem de modificar o no el valor de la resolució per tal dŽexecutar la comanda PROCHECK.

    La resolució dŽuna estructura es pot consultar tot revisant lŽarxiu .pdb o .ent, des dŽun editor de text.

    ... i els arxius de sortida:


    PROCHECK de P11018pdb1 i P11018pdb2
    Arxius de sortida
    P11018pdb1P11018pdb2Descripció
    SummarySummary

    P11018pdb1.sum i P11018pdb2.sum

    P11018pdb1_01.ps i P11018pdb2_01.ps:

    Diagrama de Ramachandran per a tota lŽestructura

    P11018pdb1_02.ps i P11018pdb2_02.ps:

    Diagrama de Ramachandran per a cadasqun dels residus

    P11018pdb1_03.ps i P11018pdb2_03.ps:

    Valors de Chi

    P11018pdb1_04.ps i P11018pdb2_04.ps:

    Paràmetres de la cadena principal

    P11018pdb1_05.ps i P11018pdb2_05.ps:

    Paràmetres de la cadena lateral

    P11018pdb1_06.ps i P11018pdb2_06.ps:

    Propietats del residus

    P11018pdb1_07.ps i P11018pdb2_07.ps:

    Distància dels enllaços en la cadena principal

    P11018pdb1_08.ps i P11018pdb2_08.ps:

    Angles dels enllaços en la cadena principal

    P11018pdb1_09.ps i P11018pdb2_09.ps:

    Valors de RMS

    P11018pdb1_10.ps i P11018pdb2_10.ps:

    Geometria de distorsió


  3. MODELS EXPERIMENTALS OBTINGUTS


    Un cop repassades les comandes amb el model de classe, ara procedirem a revisar el fet per mi...

    Els meus models segueixen les mateixes comandes que el model anterior dŽexemple, excepte a partir de lŽexecució del programa MODELLER. Mentre a classe vam usar un arxiu p7.top per a executar el programa tal qual, ara us mostro aquest arxiu modificat amb les estructures utilitzades per mi en ambdós models.

    LŽarxiu probl.top, lŽequivalent al model de la pràctica 5.1 (Clustalw): 


    # PRIMER: STEP 5
#
# This script should produce two models, 1fdx.B999901 and 1fdx.B999902.
# 
# Before you run this script, do this: ln alignment.seg.ali fer2.ali
#

INCLUDE                             # Include the predefined TOP routines


SET ALNFILE  = 'llista2.ali'        # alignment filename
SET KNOWNS   = '1av7SEQ' '1pekSEQE' '1scjSEQA'      # codes of the templates
SET SEQUENCE = 'P11018'             # code of the target
SET ATOM_FILES_DIRECTORY = './'     # directories for input atom files
SET STARTING_MODEL= 1               # index of the first model 
SET ENDING_MODEL  = 2               # index of the last model
                                    # (determines how many models to calculate)
SET DEVIATION     = 2.0             # have to be >0 if more than 1 model
SET RAND_SEED     = -12312          # to have different models from another TOP file

CALL ROUTINE = 'model'              # do homology modelling


    ... i lŽarxiu probl2.top, corresponent al model obtingut per a la pràctica 5.2 (HMM): 


    # PRIMER: STEP 5
#
# This script should produce two models, 1fdx.B999901 and 1fdx.B999902.
# 
# Before you run this script, do this: ln alignment.seg.ali fer2.ali
#

INCLUDE                             # Include the predefined TOP routines


SET ALNFILE  = 'alinia2.ali'        # alignment filename
SET KNOWNS   = '1c9jSEQA' '1pekSEQE'      # codes of the templates
SET SEQUENCE = 'P11018'             # code of the target
SET ATOM_FILES_DIRECTORY = './'     # directories for input atom files
SET STARTING_MODEL= 1               # index of the first model 
SET ENDING_MODEL  = 2               # index of the last model
                                    # (determines how many models to calculate)
SET DEVIATION     = 2.0             # have to be >0 if more than 1 model
SET RAND_SEED     = -12312          # to have different models from another TOP file

CALL ROUTINE = 'model'              # do homology modelling


    Cal apreciar que per al primer model, he utilitzat tres templates (.pdb) i per al segon, només dos.

    Això és: durant la pràctica vam tenir força dificultats per a executar el programa MODELLER degut a problemes amb les estructures, així que el nombre màxim de templates que he pogut fer servir (tot i haver-ho intentat força cops!) per a cada model, són aquests.

    Els models que he obtingut de lŽexecució del programa MODELLER, han estat:

    ... per al primer model (pràctica 5.1: Clustalw):


    [e14910.bio.acexs.au.upf@au48239 practica5_4]$ mod probl.top
    [e14910.bio.acexs.au.upf@au48239 practica5_4]$ mv probl.B99990001 probl1amb3.ent
    [e14910.bio.acexs.au.upf@au48239 practica5_4]$ mv probl.B99990002 probl1amb3_2.ent
    [e14910.bio.acexs.au.upf@au48239 practica5_4]$ rasmol probl1amb3.ent
    [e14910.bio.acexs.au.upf@au48239 practica5_4]$ rasmol probl1amb3_2.ent


    ... i per al segon dels models (pràctica 5.2: HMM):


    [e14910.bio.acexs.au.upf@au48239 practica5_4]$ mod probl2.top
    [e14910.bio.acexs.au.upf@au48239 practica5_4]$ mv probl2.B99990001 probl2amb2.ent
    [e14910.bio.acexs.au.upf@au48239 practica5_4]$ mv probl2.B99990002 probl2amb2_2.ent
    [e14910.bio.acexs.au.upf@au48239 practica5_4]$ rasmol probl2amb2.ent
    [e14910.bio.acexs.au.upf@au48239 practica5_4]$ rasmol probl2amb2_2.ent


    Un cop més, de lŽexecució de PROCHECK en resulten diversos arxius:


    Per al model probl1amb3.ent i probl1amb3_2.ent:

    [e14910.bio.acexs.au.upf@au48239 practica5_4]$ procheck_single probl1amb3.ent 2.6
    [e14910.bio.acexs.au.upf@au48239 practica5_4]$ procheck_single probl1amb3_2.ent 2.6



    PROCHECK de probl1amb3
    Arxius de sortida
    probl1amb3.entprobl1amb3_2.entDescripció
    SummarySummary

    probl1amb3.sum i probl1amb3_2.sum

    probl1amb3_01.ps i probl1amb3_2_01.ps:

    Diagrama de Ramachandran per a tota lŽestructura

    probl1amb3_02.ps i probl1amb3_2_02.ps:

    Diagrama de Ramachandran per a cadasqun dels residus

    probl1amb3_03.ps i probl1amb3_2_03.ps:

    Valors de Chi

    probl1amb3_04.ps i probl1amb3_2_04.ps:

    Paràmetres de la cadena principal

    probl1amb3_05.ps i probl1amb3_2_05.ps:

    Paràmetres de la cadena lateral

    probl1amb3_06.ps i probl1amb3_2_06.ps:

    Propietats del residus

    probl1amb3_07.ps i probl1amb3_2_07.ps:

    Distància dels enllaços en la cadena principal

    probl1amb3_08.ps i probl1amb3_2_08.ps:

    Angles dels enllaços en la cadena principal

    probl1amb3_09.ps i probl1amb3_2_09.ps:

    Valors de RMS

    probl1amb3_10.ps i probl1amb3_2_10.ps:

    Geometria de distorsió


    I per al model probl2amb2.ent i probl2amb2_2.ent:

    [e14910.bio.acexs.au.upf@au48239 practica5_4]$ procheck_single probl2amb2.ent 2.2
    [e14910.bio.acexs.au.upf@au48239 practica5_4]$ procheck_single probl2amb2_2.ent 2.2



    PROCHECK de probl2amb2
    Arxius de sortida
    probl2amb2.entprobl2amb2_2.entDescripció
    SummarySummary

    probl2amb2.sum i probl2amb2_2.sum

    probl2amb2_01.ps i probl2amb2_2_01.ps:

    Diagrama de Ramachandran per a tota lŽestructura

    probl2amb2_02.ps i probl2amb2_2_02.ps:

    Diagrama de Ramachandran per a cadasqun dels residus

    probl2amb2_03.ps i probl2amb2_2_03.ps:

    Valors de Chi

    probl2amb2_04.ps i probl2amb2_2_04.ps:

    Paràmetres de la cadena principal

    probl2amb2_05.ps i probl2amb2_2_05.ps:

    Paràmetres de la cadena lateral

    probl2amb2_06.ps i probl2amb2_2_06.ps:

    Propietats del residus

    probl2amb2_07.ps i probl2amb2_2_07.ps:

    Distància dels enllaços en la cadena principal

    probl2amb2_08.ps i probl2amb2_2_08.ps:

    Angles dels enllaços en la cadena principal

    probl2amb2_09.ps i probl2amb2_2_09.ps:

    Valors de RMS

    probl2amb2_10.ps i probl2amb2_2_10.ps:

    Geometria de distorsió



    A continuació realitzarem una superposició dels quatre models obtinguts i tot seguit passarem a visualitzar-ne els resultats.

    El programa que utilitzarem per tal de produir un aliniament estructural dels diferents models, serà XAM.

    Val a dir que abans dŽexecutar aquest programa i per tal dŽobtenir un valor de RMSD fiable, hem retallat les cues de cada model, ja que aquestes zones acumulen un grau dŽincertesa molt gran.

    Així doncs un cop tallades les cues, els models han passat a denominar-se:


    1. probl1amb3.ent: model1.pdb
    2. probl1amb3_2.ent: model2.pdb
    3. probl2amb2.ent: model3.pdb
    4. probl2amb2_2.ent: model4.pdb


    De lŽexecució del programa XAM, tot comparant els quatre models (model1.pdb, model2.pdb, model3.pdb i model4.pdb) els uns contra els altres i utilitzant tota la seqüència secera (un cop retallades les cues, resten 283 residus dŽun total de 309), nŽobtenim els resultats següents:



    ... i ja per a finalitzar, realitzarem una superposició dels diferents models amb els seus respectius templates (.pdb) emprats per a cadascun dels casos.

    Per a realitzar aquest pas, emprarem el programa STAMP. I de lŽexecució dŽaquest, en resulten els següents arxius:

    ...stamp... : outstampprobl1amb3 i outstampprobl2amb2

    ...aconvert... : outaconvertprobl1amb3 i outaconvertprobl2amb2

    ... i les estructures superposades visualment: probl1amb3.4.pdb i probl2amb2.3.pdb


    Cal observar que de la comparació dels models amb els seus templates, es pot concluir que les estructures s'alinien estructuralment força bé exceptuant els loops, que són la regió més variable (ja ho hem pogut comprovar quan hem avaluat el valor de RMSD).